Работа 18. Качественные реакции на стероиды

 

Стероидные соединения – стерины и стериды, широко распространены в животных и растительных организмах. Типичным представителем стероидов организма животных (зоостеринов) является холестерин, который находится в тканях и жидкостях в свободном виде или в виде холестеридов, т.е. эфиров пальмитиновой, стеариновой или олеиновой кислот. Особенно богата холестерином нервная ткань, где его содержится до 20-30 г/кг, причем больше всего холестерина в белом веществе головного и спинного мозга, где его концентрация достигает 40-55 г/кг. Высоко содержание холестерина в ланолине, который используется в фармации для приготовления мазей.

Холестерин извлекается из биологического материала хлороформом, горячим этиловым спиртом, диэтиловым эфиром, ацетоном и др. На практике чаще всего используют смеси органических растворителей. В воде холестерин набухает и образует эмульсии; в отличие от других липидов он не разрушается под действием концентрированных щелочей.

К растительным стеринам (фитостерины) относятся эргостерин, стигмастерин, β-ситостерин, фукостерин, которые содержатся в растительных маслах, плодах, водорослях и т.д. В лекарственных растениях (наперстянка, горицвет, ландыш, кендырь и др.) имеются сердечные гликозиды, агликоны которых представляют собой тоже скелет стерана.

 

Реактивы. Сульфат кальция (гипс), порошок; хлороформ; серная кислота, конц.; уксусный ангидрид; смесь формалина с конц. серной кислотой (1:50).

Оборудование. Штатив с пробирками; весы аптечные; ступка с пестиком; стеклянная пластинка (100х100 мм); лопаточка; воронка с бумажным фильтром; сушильный шкаф, отрегулированный на 60˚С; скальпель; пипетка вместимостью 5 мл; глазные пипетки.

Материал.

1. Мозг лабораторного животного.

2. Растительное масло.

 

Для выделения холестерина 3 г ткани мозга тщательно растирают с двукратным количеством гипса. Густой гомогенат распределяют лопаточкой по стеклянной пластинке и высушивают в сушильном шкафу при 60˚С. Высушенную массу счищают скальпелем в сухую ступку, растирают и переносят в сухую пробирку. В пробирку добавляют 6 мл хлороформа и содержимое взбалтывают 5 мин. Отфильтровывают хлороформный экстракт через сухой бумажный фильтр в сухую пробирку и проделывают с ним перечисленные ниже реакции.

 

а. Реакция Гупперт-Сальковского. Метод основан на дегидратации молекулы холестерина под действием концентрированной серной кислоты с образованием холестерилена, имеющего красную окраску:

 

 

 

	холестерин
		холестерилен

 

Ход определения. В пробирку наливают 1 мл хлороформного экстракта мозга и осторожно подслаивают по стенке пробирки 1 мл концентрированной серной кислоты. Пробирку легко встряхивают. На границе двух жидкостей появляется кольцо красного цвета, затем вся жидкость принимает последовательно красную, оранжевую и красно-фиолетовую окраску.

б. Реакция Либермана-Бурхарда. Метод основан на дегидратации холестерина с последующим соединением двух образовавшихся молекул холестерина в бихолестадиен:

Бихолестадиен в присутствии уксусного ангидрида и сульфокислоты дает сульфопроизводные зеленого цвета.

Ход определения. В сухую пробирку наливают 2 мл хлороформного экстракта мозга и добавляют в нее 10 капель уксусного ангидрида и 2 капли концентрированной серной кислоты. Появляется вначале красное окрашивание, переходящее затем в сине-зеленое и зеленое.

в. Реакция Витби. Метод, как и в предыдущих реакциях, основан на образовании окрашенных производных дегидратированного и окисленного холестерина под действием серной кислоты.

Ход определения. В одну пробирку вносят 2 мл хлороформного экстракта мозга, в другую – 2-3 капли растительного масла и 1 мл хлороформа. В обе пробы добавляют по 20 капель смеси формалина с серной кислотой и встряхивают. Растворы делятся на два слоя – верхний (хлороформный) окрашивается в яркий вишневый цвет, нижний (кислотный) – в тусклый буро-красный с зеленой флуоресценцией.

Из хлороформного слоя обеих пробирок отбирают пипеткой несколько капель, переносят в другие (сухие!) пробирки и прибавляют по 2 капли уксусного ангидрида. Вишневая окраска переходит в сине-зеленую.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы, отмечая их знаками «+» или «–».

В выводе указать на присутствие в исследуемом материале соответствующих стероидов, специфичность использованных реакций и их практическое значение.

 

Материал

Исследуемый компонент

Реакция

Окраска раствора

Результат

 

Практическое значение работы. Реакции на холестерин используются для обнаружения холестерина при гистохимическом и цитохимическом исследовании тканей, клеточных мазков и биологических жидкостей. Это имеет значение при нарушениях обмена холестерина, сопровождающихся отложением его в сосудах (атеросклероз), в коже (ксантоматоз) и т.д. Эти реакции характерны и для родственных холестерину соединений – стероидных гормонов, желчных кислот, растительных стеринов, поэтому применяются для качественного анализа лекарственных препаратов, содержащих указанные вещества, и для разработки методов их количественного определения.

 

ФЕРМЕНТЫ

 

Ферменты (энзимы) – биологические катализаторы белковой природы. Они содержатся во всех тканях, клетках, внутриклеточных органоидах и биологических жидкостях. Без них не осуществляется ни один химический процесс в организме. Разработка методов выделения и очистки ферментов дала возможность получить их в чистом и кристаллическом виде. Это позволило изучить структуру ферментов, активные и регуляторные центры их молекул, механизм действия, роль простетических групп в катализе и т.д. Как любые белки, ферменты подвержены денатурации, поэтому процедура их получения из биологического материала (ткани животных и растений, микроорганизмы, жидкости) должна быть щадящей, т.е. вестись при температуре 0-4˚С, при рН 5-9 (за исключением особых случаев). Среда для извлечения ферментов не должна содержать примесей тяжелых металлов, которые инактивируют ферменты.

Ферменты делятся на простые и сложные. У простых ферментов функцию контактного и каталитического участков активного центра выполняют только радикалы аминокислот; у сложных – в состав активного центра входят также коферменты и ионы металлов. Сложные ферменты без кофакторов не активны, что нужно учитывать при их идентификации.