Работа 17. Исследование фосфолипидов

 

Фосфолипиды содержат высшие насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты и их альдегиды, которые соединены эфирной связью с глицерином или сфингозином, фосфорную кислоту и остаточный спирт (холин, этаноламин, серин, инозит). В зависимости от строения различают фосфатидилхолины, фосфатидилинозиты, ацетальфосфатиды, кардиолипин и сфингофосфатиды. Особенно богаты фосфолипидами нервная ткань, желток яиц.

 

Реактивы. Этиловый спирт; 96%-ный; сульфат кальция (гипс, порошок); ацетон; хлорид калия, насыщенный раствор в 96%-ном этаноле; гидроксид натрия, 10%-ный раствор; соляная кислота, 10%-ный раствор; гидросульфит калия, безводный порошок; реактив молибдата аммония^*; нитрат калия, порошок; карбонат калия, порошок; азотная кислота, 10%-ный раствор; лакмусовая бумага.

Оборудование. Весы аптечные; ступка с пестиком; стеклянные пластинки (100х50 мм); стеклянные палочки; скальпель; глазные пипетки; пипетки вместимостью 2 и 5 мл; воронки с бумажными фильтрами; водяная баня; тигли; сушильный шкаф, отрегулированный на 60˚С.

Материал. Головной мозг лабораторного животного.

 

а. Извлечение фосфатидилхолинов из ткани мозга. Метод основан на экстракции горячим этанолом фосфатидилхолинов из мозга, осаждении их ацетоном и гидролизе в среде с гидроксидом натрия на составные части (жирные кислоты, глицерин, холин и фосфорная кислота).

Ход определения. Помещают навеску 1 г ткани мозга в ступку и тщательно растирают с 2-3 г гипса до получения густой кашицы. Кашицу распределяют тонким слоем на стеклянной пластинке при помощи скальпеля и высушивают в сушильном шкафу при 60˚С досуха.

Сухую массу соскабливают со стекла скальпелем в сухую ступку, растирают и затем переносят в сухую пробирку. Приливают 5 мл этанола, пробирку закрывают пробкой с обратным холодильником (стеклянная трубка длиной 70-80 см). Пробирку ставят в водяную баню и нагревают 10-15 мин при 70˚С (для экстракции).

Затем спиртовой экстракт отфильтровывают через бумажный фильтр. Если раствор будет мутным, то фильтрование повторяют через тот же фильтр. Фильтрат используют для анализа.

б. Обнаружение фосфатидилхолинов в экстрактах. Метод основан на нерастворимости фосфатидилхолинов в ацетоне, способности их образовывать эмульсии в воде и давать комплексное соединение с хлоридом кадмия, выпадающее в виде хлопьевидного осадка.

Ход определения. Наливают в сухую пробирку 2 мл ацетона и по каплям прибавляют спиртовой фильтрат, полученный в предыдущем опыте. Наблюдают за помутнением жидкости и выпадением осадка.

В пробирку вносят 20 капель дистиллированной воды и постепенно приливают 5 капель спиртового фильтрата мозга. Встряхивают содержимое и наблюдают за образованием устойчивой белой эмульсии.

К смеси добавляют 1 мл спиртового фильтрата мозга и прибавляют 0,5 мл спиртового раствора хлорида кадмия. Отмечают выпадение хлопьевидного осадка.

в. Выявление составных компонентов фосфатидилхолинов. Метод основан на гидролизе выделенных фосфатидилхолинов в растворе гидроксида натрия и постановке качественных реакций на составные части их молекул: жирные кислоты, глицерин, холин и фосфорную кислоту. Жирные кислоты обнаруживают добавлением соляной кислоты к гидролизату, содержащему растворимые натриевые соли жирных кислот; в результате образуются нерастворимые свободные жирные кислоты, всплывающие на поверхность.

Холин при нагревании превращается в триметиламин, имеющий запах селедочного рассола

 

нагревание

HOCH₂ — CH₂ — N⁺(CH₃)₃ → N(CH₃)₃ + НО — CH₂ — CH₂ — OH

холин триметиламин этиленгликоль

 

Триметиламин обладает выраженными основными свойствами, поэтому выявляется по посинению лакмусовой бумажки. Акролеин обнаруживается по характерному раздражающему запаху. Реакция, на которой основано обнаружение фосфорной кислоты, изложена в работе 11.

 

Ход определения.

1. Гидролиз фосфатидилхолинов. Спиртовой экстракт (фильтрат) из ткани мозга упаривают в пробирке на водяной бане и добавляют 3 мл раствора гидроксида натрия. Кипятят в течение 10 мин.

2. Открытие холина. В ту же пробирку вносят 20 капель гидролизата и нагревают. Образующийся из холина триметиламин обнаруживают по появлению запаха селедочного рассола. К отверстию пробирки подносят влажную красную лакмусовую бумажку и наблюдают изменение ее окраски.

3. Открытие жирных кислот. К оставшемуся гидролизату прибавляют по каплям раствор соляной кислоты до кислой реакции среды, обнаруживаемой по лакмусовой бумаге. На поверхность жидкости всплывают в виде хлопьевидной массы высшие жирные кислоты. Содержимое пробирки фильтруют через складчатый бумажный фильтр, на котором задерживаются жирные кислоты. Фильтрат нейтрализуют (по лакмусовой бумажке), прибавляя по каплям раствор гидроксида натрия, и упаривают на водяной бане досуха. Сухой остаток используют для реакций на глицерин и фосфорную кислоту.

4. Открытие глицерина. Часть сухого остатка переносят в сухую пробирку, добавляют несколько кристаллов безводного гидросульфата калия и осторожно нагревают. Появляется характерный запах акролеина.

5. Открытие фосфорной кислоты. Оставшийся сухой остаток сплавляют в тигле с небольшим количеством (одна глазная лопатка или на кончике скальпеля) порошка нитрата калия и карбоната натрия (сплавление проводят в вытяжном шкафу!). После охлаждения тигля к сплаву добавляют раствор азотной кислоты, смесь сливают в пробирку. К 2 мл реактива молибдата аммония приливают небольшими порциями испытуемый раствор. Смесь нагревают до кипения. При стоянии образуется желтый осадок фосфомолибдата аммония.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы и описать признаки, по которым обнаруживается соответствующее вещество.

 

Материал

Исследуемый компонент

Реакция (проба)

Результат реакции

 

В выводе указать на присутствие анализируемых фосфолипидов в ткани мозга и практическую значимость проведенного исследования.

Практическое значение работы. В клинико-биохимических исследованиях качественные реакции на фосфолипиды и их компоненты используются для обнаружения их в экстрактах биологического материала, а в фармации – при анализе лекарственных препаратов, содержащих фосфолипиды. При разделении фосфолипидов эти реакции применяются для проявления хроматограмм, а также для разработки методов количественного определения фосфолипидов.