Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Препарата лактатдегидрогеназы по Корнбергу
Реактивы. Фосфатный буфер, 0,1 М с рН 7,4*; пируват натрия, раствор 2∙10-2 М на 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,4; НАД∙Н динатриевая соль, свежеприготовленный 6∙10-3 М раствор в дистиллированной воде. Оборудование. Пипетки вместимостью 0,1; 1 и 5 мл; стеклянная палочка; секундомер; СФ или ФЭК типа КФК-2. Материал. Разведенный продажный препарат фермента 0,2 мкг/мл. Кристаллический препарат в виде суспензии в 2,2 М растворе сульфата аммония, имеющий активность около 200 ФЕ/мг белка, разводят в 1000 раз 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,4 перед опытом (1 ФЕ соответствует 1 мкмоль превращенного субстрата за 1 мин)[2].
Метод основан на непрерывном измерении скорости окисления НАД∙Н2, используемого на восстановление пирувата в реакции, катализируемой ЛДГ. По уменьшению экстинкции НАД∙Н2 при 340 нм рассчитывают количество превращенного субстрата за единицу времени. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимое превращение пирувата в лактат:
Н
СН3―С―СООН + НАД·Н2 НАД+ + СН3―С―СООН ║ │ О ОН пируват лактат
Равновесие реакции сдвинуто вправо, поэтому при изучении ЛДГ удобнее использовать в качестве субстрата пируват и НАД∙Н2 и по скорости окисления последнего рассчитать активность этого фермента. Ход определения. В кювету спектрофотометра последовательно вносят 2,4 мл фосфатного буфера, 0,2 мл раствора НАД∙Н2 и 0,1 мл образца фермента. Перемешивают стеклянной палочкой и ставят в кюветодержатель. Устанавливают шкалу отсчета экстинкции на 0,400 и ручкой «щель» выводят стрелку гальванометра (при открытой шторке) на нуль. В течение 1 мин проверяют отсутствие неферментативного окисления НАД∙Н2 (в этом случае экстинкция не падает). Добавляет в кювету 0,3 мл раствора пирувата натрия (запускают реакцию), быстро перемешивают, ручкой «щель» при открытой шторке возвращают стрелку гальванометра к нулевой отметке и включают секундомер. Снимают показания экстинкции (падение ее, начиная от отметки 0,400) через каждые 30 с в течение 2-3 мин. Если условия реакции подобраны верно, то за каждые 30 с наблюдается примерно одинаковое уменьшение экстинкции. Расчет. Удельную активность ЛДГ х (мкмоль∙мин-1∙мг-1) рассчитывают по формуле ∆Емин3,0∙1000
х = ———————, 6,22∙0,02
где ∆Емин – изменение экстинкции в ходе реакции за 1 мин; 6,22 – коэффициент экстинкции 1 мкмоль НАД∙Н2 в 1 мл среды; 3,0 – объем инкубационной смеси, мл; 0,02 – количество белка в кювете, мкг; 1000 – коэффициент пересчета количества белка в миллиграммы. Оформление работы. Рассчитать удельную активность ферментного препарата, молекулярную активность ЛДГ (учитывая, что ее молекулярная масса 135000). Сделать вывод о качестве исследуемого препарата (сохранность исходной активности, %). Практическое значение работы. Принципы измерения активности лактатдегидрогеназы спектрофотометрическим методом непрерывного наблюдения используются при исследовании других ферментных препаратов, очищенных ферментов и в клинико-биохимических лабораториях при количественном определении активности ферментов в биологических жидкостях и биоптатах в норме и при патологии.
Работа 31. Фотоколориметрический метод исследования активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по Севелу и Товареку
Реактивы. Лактат натрия, 0,45 М раствор или нейтрализованная гидроксидом натрия молочная кислота той же концентрации; пирофосфат натрия, 0,03 М раствор (Na4P2O7∙10H2O растворить в 50 мл воды, довести рН до 8,8 с помощью 1 М соляной кислоты и долить водой до 500 мл); НАД, свежеприготовленный раствор 3мг/мл; 2,4-динитрофенилгидразин, 0,2%-ный раствор в 1 М растворе соляной кислоты; гидроксид натрия, 0,4 М раствор; пируват натрия, раствор для построения калибровочного графика (содержит 11 мкг пирувата натрия или 8,8 мкг пировиноградной кислоты в 1 мл). Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1 и 5 мл; ФЭК; водяная баня с лабораторным термометром. Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на определении скорости образования пирувата в ходе окисления лактата с участием лактатдегидрогеназы сыворотки крови:
СН3―СН―СООН + НАД+ СН3―С―СООН + НАД·Н2 │ ║ ОН О лактат пируват
Пируват с 2,4-динитрофенилгидразином образует соответствующий гидразон, имеющий красно-бурое окрашивание в щелочной среде, интенсивность которого прямо пропорциональна содержанию кетокислоты:
Ход определения. Сыворотку крови разводят в 3 раза дистиллированной водой. Вносят в пробирку 0,1 мл разведенной сыворотки, 0,3 мл раствора НАД+ и ставят на 5 мин в водяную баню при 37˚С (для прогревания смеси). Во вторую пробирку добавляют 0,8 мл раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл раствора лактата натрия и нагревают на водяной бане при 37˚С. Выливают содержимое второй пробирки в первую, быстро перемешивают стеклянной палочкой, не вынимая пробирки из бани, и отмечают время начала инкубации. Через 25 мин реакцию останавливают, прибавляя 0,5 мл раствора 2,4-ДНФГ, и оставляют пробирку на 20 мин при комнатной температуре (для образования гидразона). К смеси приливают 5 мл раствора гидроксида натрия, содержимое перемешивают стеклянной палочкой и через 10 мин (после развития окраски) измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на ФЭКе при длине волны 520-560 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1 см. Контрольную пробу готовят как опытную, но разведенную сыворотку добавляют после инкубации. Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику, условия построения которого приведены в таблице.
По оси ординат откладывают значения экстинкции, а по оси абсцисс – соответствующие им единицы активности ЛДГ, выраженные в ммоль/(ч∙л). Оформление работы. Рассчитать активность фермента в исследуемой сыворотке крови, сделать вывод о возможном изменении активности и его причинах. Практическое значение работы. Определение активности лактатдегидрогеназы используется в клинико-биохимических лабораториях для диагностики и установления прогноза заболевания. В норме активность фермента составляет 0,8-4,0 ммоль/(ч∙л) и возрастает, как правило, у больных с повреждением миокарда, скелетных мышц, почек, а также при анемиях, опухолевых поражениях, остром гепатите и т.д.
Работа 32. Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по Боданскому
Фосфатазы – ферменты, отщепляющие фосфат от различных субстратов. Среди них имеются энзимы с неодинаковой специфичностью по отношению к субстратам. Щелочная фосфатаза действует в щелочной среде (чем отличается от фосфатаз, осуществляющих катализ в нейтральной или кислой средах) и является малоспецифичной. Реактивы. β-Глицерофосфат, щелочной раствор на мединаловом буфере с рН 8,6*; трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; реактив молибдата аммония*; аскорбиновая кислота, 1%-ный раствор на 0,1 М растворе соляной кислоты; дигидрофосфат калия (навеску 0,4394 г KH2PO4, предварительно высушенного в эксикаторе над серной кислотой, взвешивают на аналитических весах и растворяют в колбе вместимостью 100 мл; затем этот раствор разводят в 100 раз и используют для построения калибровочной кривой). Оборудование. Штатив с пробирками; центрифуга лабораторная с центрифужными весами; пипетки вместимостью 0,2; 1 и 5 мл; водяная баня с лабораторным термометром; ФЭК.
Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на фотоколориметрическом определении неорганического фосфора, отщепляемого от β-глицерофосфата под действием фосфатазы сыворотки крови в щелочной среде:
СН2ОН СН2ОН │ Фосфатаза │ НС―О―РО3Н2 + Н2О НС―ОН + Н3РО4 │ рН 8,6 │ СН2ОН СН2ОН β-глицерофосфат глицерин
Неорганический фосфат определяют по образованию фосфомолибдата аммония с последующим восстановлением его в молибденовую синь аскорбиновой кислотой (см. работу 11). Ход определения. В две пробирки вносят по 1 мл раствора β-глицерофосфата и помещают на 5 мин в водяную баню при 37˚С. Затем в опытную пробирку добавляют 0,2 мл сыворотки крови, перемешивают и отмечают время начала инкубации в водяной бане. Через 1 час приливают в обе пробирки по 1,8 мл раствора трихлоруксусной кислоты, а в контрольную – еще 0,2 мл сыворотки крови. Перемешивают пробы, оставляют стоять 5 мин для осаждения белка. Центрифугируют содержимое обеих проб в течение 5 мин при 3000 об/мин. Отбирают в чистые пробирки по 1,5 мл надосадочной жидкости (для определения в ней неорганического фосфата Фн) и приливают по 1 мл реактива молибдата аммония и по 1 мл раствора аскорбиновой кислоты. Через 10 мин измеряют экстинкцию опытной и контрольной проб на ФЭКе, при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против раствора реактивов (1,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1,5 мл дистиллированной воды). Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику, условия построения которого приведены в таблице.
По оси ординат откладывают значения экстинкции, а по оси абсцисс – соответствующие единицы щелочной фосфатазы, выраженные в ммоль/(ч∙л). Оформление работы. По полученным значениям экстинкции найти активность фермента. На основании этого сделать вывод о возможности изменения активности в исследуемой сыворотке и указать на предполагаемые причины. Практическое значение работы. В клинике используется определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови в основном у больных с поражениями костной ткани и печени, особенно с явлениями задержки оттока желчи. В норме активность фермента составляет 0,5-1,3 ммоль/(ч∙л). Повышение активности в сыворотке крови наблюдается при рахите (гиповитаминозе D), опухолях костной ткани, гиперпаратиреозе, механической желтухе, вирусном гепатите и т.д., а снижение – при гипотиреозе, гиповитаминозе С и др.
Исследование изоферментов
Изоферменты отличаются друг от друга несколькими физико-химическими признаками и, в частности, зарядом молекул, поэтому электрофорез издавна используется для их разделения. Изоферменты лактатдегидрогеназы были открыты одними из первых. Различают пять типов изоферментов ЛДГ, которые в порядке подвижности к аноду обозначаются: ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4 и ЛДГ5. Каждый из них представляет собой тетрамер, отличающийся составом субъединиц (см. учебник, с.226, 438).
Работа 33. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы сыворотки крови методом электрофореза в полиакриламидном геле по Дитцу и Лубрано
Использование в качестве среды геля полиакриламида позволяет добиться высокого разрешения при электрофорезе белков и ферментов, поскольку этот гель играет роль молекулярного сита, что обеспечивает дополнительное разделение частиц по молекулярной массе.
Реактивы. Раствор № 1 для полимеризации геля с рН 8,9 (1,0 М соляная кислота – 48 мл, трис-основание – 36,6 г, N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин, или ТЕМЕД – 0,23 мл и дистиллированная вода до 100 мл); раствор № 2 (акриламид – 30,0 г, N,N-метиленбисакриламид – 0,8 г и дистиллированная вода до 100 мл); персульфат аммония, 0,14%-ный свежеприготовленный раствор; сахароза, 40%-ный раствор; электродный буфер с рН 8,9 (трис-основание – 6,0 г, глицин – 28,8 г, дистиллированная вода до 1 л; перед употреблением разводят в 10 раз); уксусная кислота, 7%-ный раствор; фосфатный буфер, 0,5 М с рН 7,4; лактат натрия, 1 М раствор; НАД, 10 г/л раствор; нитротетразолиевый синий (НС), 1 г/л раствор; феназинметасульфат (ФМС), 1 г/л раствор; хлорид магния, 0,005 М раствор; хлорид натрия, 0,1 М раствор. Оборудование. Колба коническая вместимостью 25 мл; пипетки с оттянутым тонким концом; фильтровальная бумага; стеклянные палочки; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1,5 и 10 мл; резиновые колпачки; аппарат для электрофореза со стеклянными трубочками; источник постоянного напряжения; микроденситометр; спектрофотометр или ФЭК. Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на разной электрофоретической подвижности изоферментов ЛДГ, положение которых на столбиках полиакриламидного геля выявляется с помощью веществ, переносящих водород от лактата через феназинметасульфат на нитротетразолиевый синий. В результате в месте нахождения фракции ЛДГ выпадает фиолетово-синий осадок диформазана. Ход определения. Для полимеризации геля берут сухие чистые стеклянные трубочки, закрывают их с одного конца резиновыми колпачками, устанавливают в штативе строго перпендикулярно и вносят в них каплю раствора сахарозы. Затем готовят полимеризующую смесь, состоящую из растворов № 1, № 2, персульфата аммония и дистиллированной воды в соотношении 1:2:4:1. Смеси готовят из расчета 2 мл на одну трубочку.
Приготовленную полимеризующую смесь разливают в стеклянные трубочки, используя по 2 мл на каждую. Затем на поверхность этого раствора осторожно наслаивают 0,2-0,3 мл дистиллированной воды пипеткой с тонким оттянутым концом (это улучшает полимеризацию геля в трубочках, которая протекает без доступа кислорода воздуха, и формирует гладкую поверхность геля). Через 30 мин обычно полимеризация завершается, о чем свидетельствует ясно различимая граница между полиакриламидным гелем и водой. После этого переворачивают трубочки и осторожно стряхивают с геля наслоенную воду, а остатки воды удаляют из трубочки с помощью фильтровальной бумаги. Стеклянные трубочки с заполимеризованным гелем закрепляют в гнездах верхней камеры для электрофореза. На поверхность геля в трубочке наносят сначала 0.1 мл сыворотки крови, затем такой же объем раствора сахарозы и перемешивают нанесенные жидкости стеклянной палочкой. Осторожно наслаивают на эту жидкость разведенный в 10 раз электродный буфер, заполняя им пространство до верхнего края трубочки. Нижнюю камеру аппарата заливают тем же электродным буфером, устанавливают верхнюю камеру над нижней так, чтобы нижние концы трубочек были погружены в электродный буфер. Затем верхнюю камеру тоже заполняют электродным буфером. Аппарат для электрофореза ставят в холодильник. Электроды подключают к источнику постоянного напряжения: нижний электрод к аноду, верхний к катоду (см. рис. 3). В течение первых 10 мин электрофорез проводят при силе тока 2 мА на каждую трубочку. Затем силу тока увеличивают до 4 мА. Длительность электрофореза около 90 мин. Пока идет электрофорез, для выявления изоферментов ЛДГ готовят в колбе инкубационную смесь следующего состава: растворы лактата натрия, хлорида магния, НАД – по 1 мл, фосфатного буфера и НС – по 2,5 мл и ФМС– 0,25 мл. Перемешивают содержимое колбочки. По окончании электрофореза гели извлекают из трубочек. Для этого используют шприц на 10-20 мл с тонкой длинной иглой. Вводят иглу между стенкой трубочки и гелем. Круговыми движениями отслаивают гель, постоянно выдавливая воду из шприца и продвигая иглу к противоположному концу трубки. При этом столбик геля легко выскакивает из трубки. Столбик геля помещают в пробирки диаметром 7-8 мм и наливают в них инкубационную смесь так, чтобы весь столбик геля был погружен в проявляющую жидкость. Пробирки ставят в термостат при 37˚С на 40-60 мин. Изоферменты ЛДГ выявляются в виде сине-фиолетовых колец на столбике геля. По истечении инкубации столбики геля промывают водой, переносят в пробирки, содержащие раствор уксусной кислоты, и хранят в темноте. Количественную обработку гелевых изоэнзимограмм проводят спектрофотометрическим методом или посредством денситометрии. В первом случае лезвием вырезают окрашенные участки геля, помещают их в пробирки и заливают 1 мл подогретого до +80-85˚С раствора диметилформамида. Затем окрашенную жидкость сливают в микрокюветы и измеряют экстинкцию на спектрофотометре или ФЭКе при 540 нм против раствора диметилформамида. Второй способ обработки заключается в сканировании гелей на микроденситометре. Денситограммы подвергаются количественной обработке. Расчет. Относительную активность каждого изофермента х (%) выражают в процентах от суммы экстинкций всех изоферментов ЛДГ:
ЕА100% Е100 х = ——————, или, упрощенно, х = ———, ∑Е ∑Е
где Е – экстинкция элюата изофермента из зоны геля, относящаяся к данному изоферменту; ∑Е – сумма экстинкций всех изоферментов; А – активность ЛДГ сыворотки крови, ммоль/(ч·л). Оформление работы. Зарисовать полученную изоэнзимограмму и рассчитать относительную активность изоферментов ЛДГ (в %). Сделать вывод о сдвигах спектра изоферментов ЛДГ в исследуемой сыворотке и указать на вероятные причины этого явления. Практическое значение работы. Состав изоферментов ЛДГ имеет внутриклеточную, тканевую и видовую специфичность. Тканевые различия изоферментного спектра ЛДГ явились предпосылкой для использования его в диагностике и прогнозе ряда заболеваний, сопровождающихся некрозом органов и тканей. Известно, что в сердечной мышце, нервной ткани, почках высокая активность ЛДГ1 и ЛДГ2 (изоферменты Н-типа), в поджелудочной железе и легочной ткани преобладает ЛДГ3, а в скелетной мышце и печени – ЛДГ4 и ЛДГ5 (изоферменты М-типа). При некрозе этих тканей находящиеся в них изоферменты поступают в кровь и изменяют ее нормальный спектр. В норме сыворотка крови имеет примерно следующие соотношения изоферментов (в % от общей активности): ЛДГ1 – 32, ЛДГ2 – 47, ЛДГ3 – 12, ЛДГ4 – 5, ЛДГ5 – 4. При инфаркте миокарда в сыворотке крови увеличивается доля ЛДГ1 и ЛДГ2 (спектр смещается в сторону изоферментов Н-типа), причем этот сдвиг определяется размерами очага некроза в сердце. Заживление сопровождается нормализацией состава изоферментов в сыворотке крови. При инфекционном гепатите повышена относительная активность ЛДГ4 и ЛДГ5. Если она сохраняется при клиническом выздоровлении, то это свидетельствует о незавершенности восстановительных процессов в печени. При поражении поджелудочной железы (панкреатит), легочной ткани увеличивается относительная активность ЛДГ3 в сыворотке крови.
Работа 34. Определение активности γ-глутамилтрансферазы В сыворотке крови
Реактивы. L-γ-глутамил-п-нитроанилид; натрия хлорид; глицил-глицин*; субстратно-буферный раствор*; уксусная кислота ледяная, раствор 100 г/л; основной калибровочный раствор п-нитроанилида*. Оборудование. Пипетки на 0,1; 1,0 и 5,0 мл; термостатирующая водяная баня; спектрофотометр или фотоэлектроколориметр. Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на определении п-нитроанилида, образующегося из L-γ-глутамил-п-нитроанилида при ферментативном переносе L-γ-глутамилового остатка на глицил-глицин. ГТФ γ-глутамил-п-нитроанилид + глицил-глицин γ-глутамил-глицилглицид + п-нитроанилин
Ход определения. В опытную пробирку вносят 0,5 мл раствора субстрата и помещают в водяную баню при температуре 37°С. Через 5 минут приливают 0,05 мл сыворотки крови, содержимое перемешивают и инкубируют точно 15 минут при температуре 37°С. Затем прибавляют 3 мл раствора уксусной кислоты и перемешивают. Контрольную пробу ставят также как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации. Измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм или на ФЭКе при длине волны 400-500 нм (фиолетовый или синий светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против контрольной пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов. Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику. Оформление работы. По полученным значениям экстинкции найти активность фермента. На основании этого сделать вывод о возможности изменения активности в исследуемой сыворотке и указать на предполагаемые причины. Практическое значение работы. В клинике используется определение активности γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови в основном при заболеваниях печени и желчных путей. В норме активность составляет для мужчин 250-1767 нмоль/с·л (15-106 МЕ), для женщин – 167-1100 нмоль/с·л или 10-66 МЕ. Повышение активности фермента наблюдается при заболеваниях желчных путей с явлениями обтурации, при гепатитах, опухолях и метастазах в печень. Следует отметить, что увеличение γ-глутамилтрансферазы, как правило, увеличивается параллельно активности щелочной фосфатазы, но активность γ-глутамилтрансферазы возрастает раньше, остается повышенной более длительное время и относительное увеличение активности фермента в несколько раз выше, чем щелочной фосфатазы. Следует отметить, что наркотики, седативные средства, этанол, стимулируют активность фермента, что используется для диагностики алкогольно-токсических заболеваний печени. БИОХИМИЯ ПИЩЕВАРЕНИЯ
Пищеварение – это ферментативный гидролиз компонентов пищи. Для оценки его используются методы исследования активности ферментов и других компонентов пищеварительных соков, играющих вспомогательную роль в переваривании питательных веществ, например, соляная кислота, желчные кислоты, ионы кальция и т.д. Отклонения в составе пищеварительных соков или появление в них компонентов, не содержащихся в физиологических условиях, дают важную информацию о патологии пищеварения.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2017-01-24; просмотров: 193; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.224.149.242 (0.085 с.) |