Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Работа 41. Выявление гликолиза в мышечной ткани
Для оценки вклада гликолиза в энергетику клеток измеряют скорость этого процесса при оптимальных условиях. С этой целью добавляют в среду, содержащую исследуемый материал (клетки, срезы или кусочки тканей, гомогенат ткани), один из субстратов гликолиза (гликогенолиза), чаще всего глюкозу, гликоген, фруктозобисфосфат и др., необходимые кофакторы и создают анаэробные условия. Обязательным компонентом при изучении скорости гликолиза является неорганический фосфат, который расходуется в этом процессе на образование АТФ из АДФ. Индикаторами гликолиза служат скорость убыли глюкозы или накопления молочной кислоты, а также потребление Фн при анаэробном распаде углеводов в тканях. Реактивы. Фосфатный буфер, 0,1 М раствор с рН 8,0*; глюкоза, 10 г/л раствор, свежеприготовленный; трихлоруксусная кислота, 100 г/л раствор; сульфат меди (II), 100 г/л раствор; серная кислота, конц.; гваякол, 1,0 г/л раствор в 70%-ном этаноле; о-толуидиновый реактив*; фторид натрия, 3 М раствор; вазелиновое масло; оксид кальция, порошок, навески по 0,25 г в бумажных пакетиках. Оборудование. Водяная баня с лабораторным термометром; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; глазные пипетки; воронки со складчатыми бумажными фильтрами; стеклянные палочки; аптечные весы с разновесами. Материал. Мышечная ткань (свежая) забитого животного.
Метод основан на выявлении убыли глюкозы и накопления молочной кислоты в среде под действием ферментов гликолиза мышечной ткани в присутствии и в отсутствие фторида натрия, являющегося ингибитором гликолиза. Глюкоза обнаруживается по реакции с о-толуидином, в результате чего образуется окрашенное соединение зеленого цвета при нагревании в среде с уксусной кислотой. Молочная кислота при нагревании с концентрированной серной кислотой превращается в ацетальдегид, дающий с гваяколом характерное красное окрашивание. Ход определения. В три пробирки отмеривают по 2 мл фосфатного буфера и по 1 мл раствора глюкозы. Затем в первую пробу добавляют 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, а во вторую – 0,2 мл раствора фторида натрия. Мышечную ткань мелко измельчают ножницами и вносят во все пробирки по 1 г мышечной кашицы, содержимое тщательно перемешивают стеклянной палочкой и приливают 10 капель вазелинового масла (для защиты от кислорода воздуха). Пробирки выдерживают на водяной бане при 37˚С в течение 30 мин. После инкубации во вторую и третью пробы добавляют по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают.
Содержимое всех пробирок фильтруют через бумажный фильтр в чистые пробирки. С фильтратом проделывают реакции на глюкозу и молочную кислоту. Для проведения реакции на глюкозу берут по 0,1 мл фильтрата, переносят его в чистые пробирки и добавляют в них по 0,4 мл воды и по 2,0 мл о-толуидинового реактива. Помещают пробирки в водяную кипящую баню на 8 мин, после чего охлаждают под струей холодной воды. Сравнивают интенсивность окраски исследуемых проб. Для проведения реакции на молочную кислоту к оставшемуся фильтрату в обеих пробах добавляют по 5 капель раствора сульфата меди и по 0,25 г оксида кальция (для осаждения углеводов, которые мешают обнаружению молочной кислоты). Пробы оставляют стоять 10 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая их. Затем содержимое пробирок фильтруют через бумажный фильтр в две чистые пробирки, помещенные в лед или снег. Отбирают по 10 капель фильтрата и осторожно добавляют в каждую из них по 30 капель концентрированной серной кислоты. Все пробирки помещают на 5 мин в кипящую водяную баню (для превращения молочной кислоты в ацетальдегид). Затем пробирки охлаждают и добавляют по 2 капли спиртового раствора гваякола. Через 20 мин сравнивают интенсивность окрашивания в пробах. Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы.
Сделать вывод о наличии гликолиза в мышечной ткани и о методических подходах к его изучению. Практическое значение работы. При анаэробном распаде углеводов образуется две молекулы АТФ на одну молекулу расщепленной глюкозы, что является важным дополнительным источником образования энергии. В эритроцитах гликолиз является единственным способом производства энергии. В анаэробных условиях, когда организм испытывает недостаток кислорода, этот путь образования энергии является основным для сохранения жизнедеятельности тканей. В эксперименте и клинике определение скорости гликолиза в клетках крови и биоптатах широко используется для оценки образования энергии анаэробным путем. Кроме того, этот метод позволяет изучить механизм действия различных лекарственных препаратов и ядов, которые могут оказывать отрицательное действие, блокируя одну из стадий ферментативного процесса.
Работа 42. Анализ адениннуклеотидов методом ионообменной тонкослойной хроматографии
Реактивы. Стеклянные пластинки (9х12 см) с нанесенным тонким слоем диэтиламиноэтилцеллюлозы (ДЭАЭ-целлюлоза), являющейся анионообменной смолой; соляная кислота, 0,02 М раствор. Оборудование. Химический стакан; глазная пипетка; лист белой бумаги; вентилятор; хроматоскоп. Материал. Аденозинтрифосфат натрия, 1%-ный раствор для инъекций.
Метод основан на эффекте ионного обмена, состоящего в том, что адениннуклеотиды, имеющие отрицательный заряд, взаимодействуют с положительными группами ДЭАЭ-целлюлозы (неподвижная фаза), а при прохождении по адсорбенту раствора соляной кислоты нуклеотиды замещаются на анионы Clˉ. При этом легче всего вытесняется АМФ, из-за чего он продвигается дальше всех, затем АДФ и АТФ, который остается рядом с линией старта[3]. Просматривают хроматограмму в ультрафиолетовом свете, в котором нуклеотиды, вследствие поглощения при 260 нм, выглядят в виде темных пятен. Ход определения. Стеклянную пластину с ДЭАЭ-целлюлозой кладут адсорбентом вверх на лист белой бумаги и, отступив от края пластинки на 2 см, проводят простым карандашом линию старта, а в центре очерчивают кружок диаметром 3-4 мм для нанесения исследуемой пробы. Наносят глазной пипеткой каплю раствора натрия аденозинтрифосфата в центр кружка и подсушивают пятно на воздухе в течение 5 мин с помощью вентилятора. В химический стакан, который используют как хроматографическую камеру, наливают раствор соляной кислоты так, чтобы слой жидкости был высотой примерно 1 см. Опускают конец пластинки с нанесенной пробой в раствор соляной кислоты. Для герметичности стакан закрывают лоскутом резиновой перчатки, натянув его и закрепив с помощью резинового колечка. После того как фронт растворителя достигает верхнего края пластинки, ее вынимают из стакана и подсушивают на воздухе с помощью вентилятора. Хроматограмму помещают в хроматоскоп и в ультрафиолетовом свете очерчивают простым карандашом темные пятна разделившихся адениннуклеотидов. Оформление работы. Зарисовать положение пятен адениннуклеотидов на хроматограмме и сделать вывод о качестве исследуемого препарата АТФ для инъекций. Практическое значение работы. Разделение нуклеотидов методом тонкослойной ионообменной хроматографии используется для изучения состава нуклеотидов и определения их содержания в тканях, а также для расчета энергетического заряда адениловой системы в норме и при различных патологических состояниях. В фармации этот метод используется для контроля качества препаратов, содержащих адениннуклеотиды.
Работа 43. Определение активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови по Эннору и Розенбергу
Реактивы. Креатинфосфат, 0,006 М раствор; аденозиндифосфат динатриевая соль, 6,0 г/л раствор; трис-буфер, 0,1 М раствор с рН 7,2, содержащий 0,1 моль/л хлорида магния; сульфат цинка, 50 г/л раствор; гидроксид бария, 50 г/л раствор; щелочной реактив, содержащий 160 г/л карбоната натрия и 60 г/л гидроксида натрия; диацетил, рабочий раствор; α-нафтол, 10 г/л раствор; креатин, стандартный раствор концентрации 0,1 ммоль/л.
Примечание. Все перечисленные реактивы, кроме трис-буфера, готовят перед употреблением. Оборудование. Штатив с пробирками; стеклянные палочки; пипетки вместимостью 1 мл; водяная баня с лабораторным термометром; центрифуга лабораторная с центрифужными весами. Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на определении креатина, образующегося из креатинфосфата под действием креатинфосфокиназы, об активности которой судят по количеству выявляемого креатина. Креатин образует с диацетилом и α-нафтолом комплексное соединение, интенсивность розовато-желтой окраски которого пропорциональна концентрации креатина. Ход определения. В две пробирки последовательно вносят следующие реактивы (объемы растворов указаны в миллилитрах):
Обе пробирки помещают на 3 мин в водяную баню при 37˚С, не вынимая из бани, прибавляют в них по 0,2 мл раствора АДФ (запускают креатинкиназную реакцию). Отмечают время начала инкубации. Через 30 мин реакцию останавливают, последовательно добавляя в обе пробы по 0,2 мл гидроксида бария и сульфата цинка. Содержимое пробирок охлаждают и оставляют стоять 10 мин (для осаждения белка). Затем осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5-10 мин. Отбирают по 0,5 мл надосадочной жидкости в две чистые пробирки и приливают в них по 3 мл дистиллированной воды, по 1 мл раствора α-нафтола и по 0,5 мл рабочего раствора диацетила. Пробы тщательно перемешивают стеклянной палочкой и помещают на 20 мин в темное место для развития окрашивания. Перед фотометрией готовят стандартную пробу и контроль стандарта. Для этого в одну пробирку (стандартная проба) вносят 0,5 мл раствора креатина, 3 мл дистиллированной воды, 1 мл α-нафтола и 0,5 мл рабочего раствора диацетила, а в другую (контроль стандарта) – те же реактивы, только вместо раствора креатина добавляют 0,5 мл дистиллированной воды. Обе пробирки выдерживают в темноте 20 мин.
Измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной и стандартной против контроля стандарта на ФЭКе при 520-540 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1,0 см. Расчет. Активность креатинфосфокиназы рассчитывают по формуле
0,00005Еоп1,2∙2∙10000 х = ————————————, Ест0,5
где х – активность креатинфосфокиназы, ммоль/(ч∙л); 0,00005 – содержание креатина в стандартной пробе, ммоль; Еоп – экстинкция опытной пробы против контроля; Ест – экстинкция стандартной пробы против контроля стандарта; 2 – коэффициент пересчета на час инкубации; 1,2 – объем проб до центрифугирования; 0,5 – объем надосадочной жидкости, взятой на исследование; 10000 – коэффициент пересчета на литр сыворотки крови. После сокращения формула приобретает следующий вид:
2,4Еоп х = ———— Ест Оформление работы. Рассчитать активность креатинфосфокиназы в сыворотке крови и по полученным данным сделать вывод о возможных изменениях активности фермента и причинах этих отклонений. Практическое значение работы. Больше всего креатинфосфокиназы в мышечной (скелетная мышца и сердце) и нервной тканях, в которых она участвует в переносе энергии. В остальных тканях и органах ее активность в 100-1000 раз ниже. Поэтому при повреждении мышечной и нервной тканей или при заболеваниях, вызывающих повышение их проницаемости, имеет место «утечка» фермента из тканей и повышение его количества в крови. В норме активность креатинфосфокиназы в сыворотке крови составляет 0,30-0,70 ммоль/(ч∙л). В клинической практике определение активности этого фермента используется при диагностике инфаркта миокарда (причем повышение активности его наблюдается через 3 ч после начала некротического процесса и достигает максимума через 24 ч), а также при дистрофии скелетных мышц, поражении нервной ткани.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2017-01-24; просмотров: 332; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.117.111.1 (0.025 с.) |