Сыворотки крови турбидиметрическим методом

По Бурштейну и Самай

 

Реактивы. Хлорид кальция, 0,025 М раствор; гепарин, содержащий 1000 единиц в 1 мл.

Оборудование. Микропипетки; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

 

Метод основан на способности гепарина образовывать с β- и пре-β-липопротеидами сыворотки крови комплекс, который под действием хлорида кальция выпадает в осадок. Степень помутнения раствора пропорциональна содержанию этих липопротеидов в сыворотке крови.

Ход определения. В контрольную и опытную кюветы ФЭКа с толщиной слоя 0,5 см наливают по 2 мл хлорида кальция. Устанавливают шкалу прибора на нулевую отметку при 720 нм (красный светофильтр).

В опытную кювету приливают микропипеткой 0,2 мл сыворотки, несколько раз промывая пипетку. Отмечают исходное значение экстинкции (Е₁). Затем добавляют микропипеткой 0,04 мл гепарина, несколько раз промывая ее, и перемешивают содержимое кюветы. Ровно через 4 мин (по секундомеру) вновь измеряют экстинкцию (Е₂).

Расчет. Содержание β- и пре-β-липопротеидов х (г/л) в сыворотке крови рассчитывают по формуле

 

х = (Е₂ – Е₁)11,65,

 

где 11,65 – эмпирический коэффициент пересчета содержания β- и пре-β-липопротеидов на г/л.

Оформление работы. По полученным значениям экстинкции рассчитать содержание определяемых липопротеидов в сыворотке крови и сделать вывод о возможных их изменениях.

Практическое значение работы. В норме содержание липопротеидов в сыворотке крови составляет 3,6-6,5 г/л. Наиболее часто наблюдается увели­чение содержания β-липопротеидов в сыворотке крови. Повышение уровня липопротеидов тесно связано с повышением содержания холестерина в крови; им наиболее богаты β-липопротеиды. Повышение β- и пре-β-липопро­теидов имеет место при заболеваниях, связанных с нарушением липидного обмена (атеросклероз, сахарный диабет и др.). Концентрация β- и пре-β-ли­попротеидов в сыворотке крови имеет значение не только для выявления на­рушений липидного обмена, но и как показатель функции печени (гепатиты).

 

 

Работа 52. Определение содержания холестерина

В сыворотке крови по методу Илька

 

Реактивы. Реактив Илька^*.

Оборудование. Пипетка для отмеривания концентрированных кислот; термостат, отрегулированный на 37˚С; микропипетки; штатив с пробирками; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

 

Метод основан на реакции Либермана-Бурхарда (см. работу 18, б). Интенсивность изумрудно-зеленой окраски пропорциональна содержанию холестерина.

Ход определения. В пробирку вносят 2,1 мл реактива Илька и приливают 0,1 мл негемолизированной сыворотки крови, которую добавляют медленно, так чтобы она стекла по стенке пробирки. Пробирку энергично встряхивают 10-12 раз и помещают в термостат на 20 мин при 37˚С. Фотометрируют на ФЭКе при 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против реактива Илька.

 

Примечание. При проведении реакции нужно пользоваться абсолютно чистыми и сухими пробирками и пипетками. Соотношение компонентов реактива Илька рассчитано так, что белки сыворотки крови не выпадают в осадок. Появление мути может быть вызвано лишь наличием воды в реактиве или посуде.

 

Расчет. Содержание холестерина определяют по калибровочному графику (рис. 7).

Оформление работы. Рассчитать содержание холестерина в исследуемой сыворотке крови и по результатам сделать вывод о возможных нарушениях в обмене холестерина.

Практическое значение работы. Содержание холестерина в сыворотке крови у здоровых людей, определенное методом Илька, составляет 3,0-6,2 ммоль/л. Повышенная концентрация холестерина в сыворотке крови (гиперхолестеринемия) наблюдается при атеросклерозе, сахарном диабете, врожденных нарушениях обмена, заболеваниях печени и т.д.

 

 

Работа 53. Определение содержания общих фосфолипидов

В сыворотке крови

 

Метод основан на определении концентрации органического фосфата, освободившегося при кислотном гидролизе. Измерение содержания неорганического фосфата проводится реакцией с молибдатом аммония, принцип которой см. работу 11.

 

Реактивы. Трихлоруксусная кислота, 0,6 М раствор; реактив молибдата аммония^*; хлорная кислота, конц.; восстанавливающий реактив^*.

Оборудование. Фильтровальная бумага; центрифуга с центрифужными весами; штатив с пробирками; пипетки для забора концентрированных кислот; пипетки вместимостью 0,1; 1 и 5 мл; песчаная баня; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Ход определения. В опытную пробирку вносят 0,2 мл сыворотки и 2,8 мл дистиллированной воды, в контрольную – 3 мл дистиллированной воды. Добавляют в обе пробирки по 3 мл раствора трихлоруксусной кислоты и встряхивают для перемешивания содержимого.

Центрифугируют опытную пробу 15 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, пробирку переворачивают на фильтровальную бумагу до полного стекания жидкости. Затем в обе пробирки приливают по 1 мл концентрированной хлорной кислоты (специальной пипеткой, осторожно!), помещают в каждую из них по две стеклянные бусинки и встряхивают их содержимое. Пробы ставят на гидролиз в песчаную баню при 180˚С на 20-30 мин (до обесцвечивания раствора).

Пробирки охлаждают на воздухе до комнатной температуры, прибавляют по 3 мл дистиллированной воды, по 1 мл реактива молибдата аммония и по 1 мл свежеприготовленного восстанавливающего реактива. Тщательно перемешивают содержимое пробирок и оставляют на 10 мин при комнатной температуре.

Фотометрируют опытную пробу против контрольной на ФЭКе при 630 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет. Содержание общих фосфолипидов х (г/л) в сыворотке крови рассчитывают по формуле

m5000∙25

х = ——————,

 

 

где m – масса неорганического фосфата в пробе, найденная по калибровочному графику (рис. 8), мг;

5000 – коэффициент пересчета на литр сыворотки крови;

10 – коэффициент пересчета миллиграммов в граммы;

25 – коэффициент пересчета (липидный фосфор составляет 4% относительной молекулярной массы фосфолипидов).

Для пересчета липидного фосфора на ммоль/л необходимо полученные результаты умножить на коэффициент 0,323.

Оформление работы. По полученному значению экстинкции рассчитать содержание общих фосфолипидов и липидного фосфора в сыворотке крови. Сделать вывод относительно полученных данных.

Практическое значение работы. Фосфолипиды сыворотки (плазмы) крови входят в состав липопротеидов, обусловливая вместе с белком полярные свойства этих смешанных макромолекул и их растворимость. В норме содержание общих фосфолипидов составляет 1,5-3,6 г/л, или 2,0-3,5 ммоль/л липидного фосфора. Важным показателем является индекс фосфолипиды/холестерин, который в физиологических условиях равен 1-1,5. Этот индекс снижается при атеросклерозе, гипертонической болезни, заболеваниях печени. Повышение концентрации фосфолипидов в сыворотке крови (гиперфосфолипидемия) наблюдается при сахарном диабете, гипотиреозе, при поражении почек и т.д. Пониженный уровень их встречается при тяжелых формах острого гепатита, жировом перерождении печени, тиреотоксикозе.

 

 

Работа 54. Разделение липидов сыворотки крови

методом тонкослойной хроматографии

 

Метод основан на различной скорости перемещения липидных фракций сыворотки крови (фосфолипиды, свободные жирные кислоты, холестерин, глицериды) в тонком слое адсорбента при движении через него органического растворителя. Скорость разделения фракций зависит от их относительной полярности, и для их обнаружения полученные хроматограммы обрабатывают парами иода.

 

Реактивы. Этанол – диэтиловый эфир (3:1); хлороформ; растворитель для хроматографии: н-гексан – диэтиловый эфир – уксусная кислота (73:25:2); иод металлический.

Оборудование. Пластинки хроматографические Силуфол УФ₂₅₄; камера для хроматографии; водяная баня; камера для проявления хроматограмм; хроматоскоп.

Материал. Сыворотка крови.

Ход определения. В мерной колбе вместимостью 25 мл смешивают 1 мл исследуемой сыворотки крови с 10 мл приготовленной спирто-эфирной смеси. Колбу с содержимым помещают на 30 с в кипящую водяную баню, охлаждают под струей холодной воды и доводят объем спирто-эфирной смесью до 25 мл. Полученный липидный экстракт отфильтровывают через обезжиренный бумажный фильтр в широкогорлую пробирку, выпаривают досуха в кипящей водяной бане, а осадок растворяют в 0,2 мл хлороформа.

В хроматографическую камеру наливают 2-3 мл растворителя. Пастеровской пипеткой наносят на хроматографическую пластину, отступя 1 см от края, 0,01-0,02 мл хлороформного экстракта, помещают пластину в камеру этим концом вниз, погрузив его на 3-5 мм в растворитель. Камеру закрывают крышкой для поддержания равномерной концентрации паров. Хроматографию проводят при комнатной температуре до тех пор, пока фронт растворителя не приблизится к верхнему краю, не доходя до него 0,5 см.

Полученную хроматограмму извлекают из камеры, высушивают на воздухе и вносят в камеру для проявления, на дно которой предварительно насыпают кристаллы металлического иода. Сосуд закрывают и подогревают в водяной бане при 60˚С. Возгоняющийся иод вступает в реакцию с липидными фракциями.

Через 1 мин хроматограмму извлекают и просматривают в ультрафиолетовом свете на хроматоскопе. Фракции липидов обнаруживают в виде коричневых пятен. Ближе к линии старта расположены фосфолипиды, затем неидентифицированные соединения, холестерин, моноглицериды, свободные жирные кислоты, триглицериды и эфиры холестерина.

Оформление работы. Зарисовать полученную хроматограмму, указав на ней соответствующие липидные фракции сыворотки крови. Указать в выводах возможность дальнейшего количественного определения липидных компонентов.

 

 

ОБМЕН БЕЛКОВ И АМИНОКИСЛОТ

 

В обмене белков можно условно выделить два этапа: первый – распад белков (в том числе апопротеинов сложных белков) до аминокислот и второй – превращение аминокислот до конечных продуктов метаболизма (мочевина, СО₂ и Н₂О) или до некоторых азотсодержащих производных (биогенные амины, креатин, порфирины и т.д.). Для оценки состояния белкового обмена организма исследуют содержание белков и отдельных их фракций в сыворотке крови, аминокислот, а также активность ферментов, катализирующих отдельные стадии превращения белков и аминокислот.

 

 

Работа 55. Определение содержания белковых фракций

сыворотки крови турбидиметрическим методом

 

Реактивы. Основной фосфатный буферный раствор и его рабочие растворы № 1-4^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1; 2,5 и 10 мл; палочки стеклянные; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

 

Метод основан на способности отдельных белковых фракций сыворотки крови осаждаться в виде мелкой взвеси в фосфатных растворах определенной концентрации. Степень мутности раствора пропорциональна содержанию белковых фракций.

Ход определения. Нумеруют шесть пробирок: 0, 1, 2, 3, 4, 5 и ставят их в штатив. В пробирку «0» (контрольная) вносят 5 мл дистиллированной воды, а в пробирки 1-4 по 5 мл соответствующих рабочих буферных растворов.

В пробирку № 5 наливают 0,5 мл сыворотки крови, 0,75 мл дистиллированной воды и 3,75 мл основного раствора фосфатного буфера, содержимое тщательно перемешивают.

Из пробирки № 5 переносят 0,5 мл в контрольную пробирку и по 0,5 мл в пробирки № 1-4, после чего содержимое их перемешивают стеклянной палочкой.

Через 15 мин определяют степень мутности (экстинкцию) растворов № 1-4 против контрольной (нулевая проба) на ФЭКе при 610-640 нм (светофильтр красный) в кювете с толщиной слоя 1 см (перед фотометрией пробирки встряхивают).

Расчет. Подобранные концентрации растворов фосфатного буфера позволяют осаждать разные фракции белков в зависимости от их изоэлектрической точки. В пробирке № 1 осаждаются все фракции; № 2 – все фракции глобулинов; № 3 –β- и γ-глобулины и № 4 – только γ-глобулины. Исходя из этого, рассчитывают содержание отдельных белковых фракций в процентах или в абсолютных величинах (в г/л).

В процентах расчет проводят следующим образом. Вычисляют Е для каждой фракции:

для альбуминов Е = Е₁ – Е₂;

для α-глобулинов Е = Е₂ – Е₃;

для β-глобулинов Е = Е₃ – Е₄;

для γ-глобулинов Е = Е₄

 

 

Полученные значения Е для каждой белковой фракции складывают и условно принимают за 100%, после чего находят содержание для каждой фракции х (в %) по формуле

 

Е_оп 100%

х = —————,

Е_общ

 

где Е_оп – экстинкция данной фракции,

Е_общ – сумма экстинкций всех фракций.

Для расчета содержания белковых фракций в абсолютных значениях предварительно определяют концентрацию белка в сыворотке крови биуретовым методом (см. работу 8) и затем делают расчеты по формуле

 

Е_оп С

х = —————,

Е_общ

 

где х – содержание данной фракции, г/л;

С – концентрация белка в сыворотке крови, определенная биуретовым методом, г/л.

Оформление работы. Рассчитать процентное и абсолютное содержание белковых фракций в сыворотке крови (для расчета в абсолютных единицах можно использовать данные содержания белка в сыворотке крови, полученные в работе 8), а также альбумин/глобулиновый индекс и сделать вывод.

Практическое значение работы. В норме содержание белковых фракций в сыворотке крови следующее: альбумины 35-60 г/л и глобулины 25-35 г/л, из них α₁-глобулины 2,5-5%, α₂-глобулины 7-13%, β-глобулины 8-14% и γ-глобулины 12-22%. В абсолютных единицах концентрация α₁-глобулинов равна 2,0-5,0, α₂-глобулинов 4,0-7,0, β-глобулинов 5,0-9,0 и γ-глобулинов 8,0-17,0 г/л. Индекс альбумины/глобулины колеблется от 1,5 до 2,3. При различных патологических состояниях происходит изменение протеинограммы. Острый воспалительный процесс характеризуется уменьшением содержания альбуминов и возрастанием содержания α-глобулинов, а в более поздние сроки – увеличением концентрации γ-глобулинов. Для хронического воспаления более типично выраженное повышение уровня α₂ и γ-глобулинов и умеренное снижение альбуминов в сыворотке крови; при злокачественных новообразованиях резко снижается содержание альбуминов с одновременным существенным увеличением всех глобулиновых фракций. Поражения печени (гепатиты, цирроз печени) сопровождаются снижением альбуминов, которые образуются в печеночной ткани, и относительным увеличением γ-глобулинов.

 

Работа 56. Определение активности катепсинов в сыворотке крови

по А.А.Покровскому, А.И.Арчакову и О.Н.Любимцевой

 

Реактивы. Ацетатный буфер, 0,1 М раствор с рН 4,0; гемоглобин, 4%-ный раствор на ацетатном буфере с рН 4,0^*; трихлоруксусная кислота, 8%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; центрифуга с центрифужными весами; спектрофотометр.

Материал. Сыворотка крови.

 

Метод основан на спектрофотометрическом определении при 280 нм кислоторастворимых продуктов гидролиза гемоглобина, образующихся под действием катепсинов сыворотки крови.

Реакция протекает по уравнению

 

Катепсины

Глобин ——————— (n + 1) Фрагменты глобина

+ nН₂О

 

Экстинкцию кислоторастворимых продуктов гидролиза глобина (пептиды, свободные аминокислоты) измеряют при 280 нм на спектрофотометре. В этой области спектра в основном поглощает тирозин и в меньшей степени триптофан и фенилаланин.

Ход определения. В опытную пробирку вносят 1 мл раствора гемоглобина и 0,5 мл сыворотки крови, а в контрольную – те же вещества в том же объеме и 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Пробы перемешивают встряхиванием.

Ставят пробирки на 60 мин в водяную баню при 37˚С, после этого приливают к опытной пробе 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают содержимое встряхиванием. Центрифугируют пробы 10 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки.

Измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на спектрофотометре при 280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет. Проводят с использованием калибровочного графика на тирозин или молярного коэффициента экстинкции тирозина:

 

Е5000

х = ——————,

0,436

где х – активность катепсинов, ммоль тирозина/(ч∙л);

Е – экстинкция опытной пробы против контрольной;

5000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

0,436 – коэффициент экстинкции 1 ммоля тирозина.

Оформление работы. По экстинкции рассчитать активность катепсинов в сыворотке крови, сделать вывод и отметить практическое значение определения данного фермента.

Практическое значение работы. Катепсины, гидролизующие белки в кислой зоне рН, специфичны для лизосом тканей, поэтому в научных исследованиях их определяют как индикаторы чистоты лизосомальной фракции. При поражении органов, особенно при некрозах, активность катепсинов в сыворотке крови увеличивается. Это явление отмечено при инфаркте миокарда, причем степень повышения ферментативной активности в сыворотке крови зависит от глубины и распространенности некротического очага в сердце.

 

 

Работа 57. Определение активности аспартат- и аланин­-

аминотрансферазы в сыворотке крови по Райтману и Френкелю

 

Реактивы. Субстратные растворы № 1 и № 2^*; 2,4-динитрофенилгидра­зин, 0,1%-ный раствор на 2 М растворе соляной кислоты; гидроксид натрия, 0,4 М раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,2; 1 и 5 мл; водяная баня; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

 

Метод основан на определении пировиноградной кислоты, которая является одним из продуктов реакции, катализируемой аланинаминотрансферазой, или продуктом декарбоксилирования оксалацетата, образующегося в реакции, катализируемой аспартатаминотрансферазой. Образовавшаяся пировиноградная кислота определяется по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином (см. работу 31).

Ход определения. Определение активности ферментов проводят по схеме

Последовательность операций	АлАТ	АсАТ
опыт	контроль	опыт	контроль
Внесение субстратных растворов	Раствор № 1 – 0,5мл	Раствор № 1 – 0,5мл	Раствор № 2 – 0,5мл	Раствор № 2 – 0,5мл
Нагревание	5 мин при 37˚С	5 мин при 37˚С
Добавление 2,4-ДНФГ	-	1,0 мл	-	1,0 мл
Добавление сыворотки	0,1 мл	0,1 мл	0,1 мл	0,1 мл
Инкубация	30 мин при 37˚С	60 мин при 37˚С
Добавление 2,4-ДНФГ	0,5 мл	-	0,5 мл	-
Экспозиция	20 мин при 18-20˚С	20 мин при 18-20˚С
Добавление гидроксида натрия	5,0 мл	5,0 мл	5,0 мл	5,0 мл
Экспозиция	10 мин при 18-20˚С	10 мин при 18-20˚С

Фотометрируют опытные пробы против контрольной на ФЭКе при 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет производят по формулам:

 

m10000 m10000∙2

х(АсАТ) = ———— или х(АлАТ) = ————,

1000 1000

где х – активность ферментов, ммоль/(ч∙л);

m – количество пировиноградной кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику (рис. 9), мкмоль;

10000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки;

1000 – коэффициент пересчета мкмоль в ммоль;

2 – для пересчета на 1 ч.

Практическое значение работы. В норме активность аланинаминотрансферазы составляет 0,1-0,68, а аспартатаминотрансферазы 0,1-0,45 ммоль/(ч∙л).

Определение активности АсАТ и АлАТ и их отношения широко используется в клинической практике для выявления патологических процессов в различных органах. В миокарде более высокая активность АсАТ, чем АлАТ, в печени обратное соотношение активности этих ферментов. При инфаркте миокарда значительно увеличивается активность АсАТ в сыворотке крови с одновременным повышением коэффициента АсАТ/АлАТ. При поражении печени (цирроз, сывороточный гепатит и т.д.) более выраженно повышается активность АлАТ и снижается коэффициент АсАТ/АлАТ.

 

 

Работа 58. Определение активности гистидазы в сыворотке крови

по Табору и Мелеру в модификации В.А.Буробина

 

Реактивы. L-гистидина моногидрохлорид, 0,2 М раствор (418 мг в 100 мл), доведенный с помощью 1 М раствора NaOH до рН 8,2; пирофосфатный буфер, 0,1 М раствор с рН 8,2^*; трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор; активирующий раствор, содержащий восстановленный глутатион и альбумин^*; уроканиновая кислота, 0,001 М раствор для построения калибровочного графика (8,7 мг дигидрата уроканиновой кислоты растворяют в 0,001 М растворе NaOH в мерной колбе вместимостью 50 мл).

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; водяная баня с лабораторным термометром; термостат, отрегулированный на 37˚С; центрифуга с центрифужными весами; спектрофотометр.

Материал. Сыворотка крови.

 

Метод основан на измерении экстинкции уроканиновой кислоты, образующейся из гистидина под действием гистидазы, в зоне ее максимального поглощения при 264 нм в кислой среде.

Ферментативная реакция протекает по уравнению

Ход работы. В две пробирки – контрольную и опытную – вносят по 0,3 мл пирофосфатного буфера, по 0,5 мл исследуемой сыворотки и по 1 мл активирующего раствора. В опытную пробирку приливают 1 мл раствора гистидина и доводят объем пробы до 3 мл дистиллированной водой. Перемешивают содержимое встряхиванием.

Обе пробирки помещают на 2 ч в водяную баню или термостат при 37˚С, затем добавляют в пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. После этого в контрольную пробу приливают 1 мл активирующего раствора, объем ее доводят до 3 мл дистиллированной водой и перемешивают содержимое встряхиванием.

Пробы центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин, после чего надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки.

Измеряют экстинкцию опытной работы против контрольной на спектрофотометре при 264 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Для построения калибровочного графика в семь пронумерованных пробирок вносят компоненты, перечисленные в приведенной ниже таблице, в указанных количествах.

Для приготовления рабочего раствора уроканиновой кислоты берут ее исходный 0,001 М раствор и разбавляют в 10 раз дистиллированной водой.

Доводят объем всех проб до 3 мл дистиллированной водой, добавляют во все пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают содержимое. Центрифугируют пробы 5 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают в чистые пробирки и измеряют экстинкцию, как указано выше.

 

 

№№ пробы	Рабочий раствор уроканиновой кислоты, мл	Пирофосфатный буфер, мл	Активирующий раствор, мл	Раствор гистидина, мл	Содержание уроканиновой кислоты в пробе, мкмоль
		0,3	1,0	1,0
	0,05	0,3	1,0	1,0	0,005
	0,10	0,3	1,0	1,0	0,010
	0,15	0,3	1,0	1,0	0,015
	0,20	0,3	1,0	1,0	0,020
	0,30	0,3	1,0	1,0	0,030
	0,40	0,3	1,0	1,0	0,040

 

Расчет производят по формуле

Е200

х = —————,

 

где х – активность гистидазы в сыворотке крови, мкмоль/(ч∙л);

Е – содержание уроканиновой кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику, мкмоль;

200 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови;

2 – коэффициент пересчета на 1 ч.

Оформление работы. По полученным экстинкциям рассчитать активность гистидазы в сыворотке крови, сравнить ее с нормой и указать причины возможных отклонений.

Практическое значение работы. Гистидаза содержится преимущественно в печени и коже человека и относится к органоспецифичным для них ферментам. При поражении этих органов, главным образом печени, наблюдается поступление этого фермента в кровь. В норме активность гистидазы в сыворотке крови определяется в виде следов примерно у 1-2% здоровых пациентов. Лишь у грудных здоровых детей регистрируется активность этого фермента в сыворотке крови. При заболеваниях печени в сыворотке крови выявляется гистидазная активность, причем степень ее увеличения характеризует тяжесть патологического процесса.

 

 

Работа 59. Определение содержания свободного гидроксипролина

в моче по Нейману и Логану в модификации П.Н.Шараева

 

Реактивы. Сульфат меди (II), 0,01 М раствор; пероксид водорода, 6%-ный раствор; серная кислота, 6 М раствор; реактив Эрлиха (5%-ный раствор n-диметиламинобензальдегида в н-пропаноле или изопропаноле); гидроксид натрия, 2,5 М раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 мл; стеклянные палочки; термостат; вода со льдом (или снегом) в стакане; водяная баня; ФЭК.

Материал. Моча, предварительно профильтрованная.

 

Метод основан на взаимодействии продукта окисления и декарбоксилирования гидроксипролина с n-диметиламинобензальдегидом, в результате чего образуется окрашенное соединение розового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации гидроксипролина в пробе.

Ход работы. В две пробирки вносят по 1 мл профильтрованной мочи, раствора сульфата меди (II), раствора гидроксида натрия и раствора пероксида водорода. Содержимое обеих пробирок перемешивают стеклянной палочкой в течение 5 мин, затем их ставят в термостат при 70˚С на 5 мин, периодически встряхивая до полного прекращения выделения пузырьков. Затем пробы охлаждают в воде со льдом или снегом. К охлажденным пробам приливают по 4 мл раствора серной кислоты и по 2 мл реактива Эрлиха и перемешивают содержимое пробирок стеклянной палочкой. После этого опытную пробирку помещают в кипящую водяную баню на 80 с, а контрольную – на то же время в воду со льдом или снегом.

Измеряют экстинкцию опытной и контрольной проб против воды на ФЭКе при зеленом светофильтре в кювете с толщиной слоя 1 см. Из экстинкции опытной пробы вычитают экстинкцию контрольной пробы и полученную величину используют для нахождения содержания гидроксипролина в пробе по калибровочному графику.

Для построения калибровочного графика отмеривают в одну пробирку 1 мл воды («слепая» проба), а в пять других (стандартные пробы) – по 1 мл раствора гидроксипролина с концентрацией его 1, 10, 15, 20 и 25 мкг/мл.

Далее пробы обрабатывают так же, как и описанные выше опытные, измеряют экстинкцию стандартных проб против «слепой» при тех же условиях.

Расчет производят по формуле

 

ЕV

х = —————,

 

где х – содержание гидроксипролина в моче, мг/сут;

Е – содержание гидроксипролина в пробе, найденное по калибровочному графику по разнице экстинкций опытной и контрольной проб, мкг;

V – суточный объем мочи, мл;

1000 – коэффициент пересчета микрограммов в миллиграмы.

Практическое значение работы. Гидроксипролин входит в состав только белков соединительной ткани – коллагена и эластина, в которых содержание данной аминокислоты составляет соответственно 10-15 и 1,5%. Выделение гидроксипролина с мочой, а также концентрация его в плазме или сыворотке крови зависит, в основном, от скорости синтеза коллагена, образования коллагеновых фибрилл и интенсивности распада коллагена в тканях.

В норме экскреция свободного гидроксипролина с мочой у взрослого человека составляет 1-8 мг, или 7,6-61,0 мкмоль в сутки. Повышенное выделение его с мочой отмечается при повреждении соединительной ткани, сопровождающемся распадом коллагена (например, при ревматизме, системной склеродермии, поражении костей и др.). Динамическое наблюдение за экскрецией гидроксипролина с мочой может дать информацию о формировании рубца в постинфарктном очаге миокарда.