Исследование порфиринового (пигментного) обмена

 

Для оценки состояния порфиринового обмена используют определение пигмента билирубина, являющегося продуктом распада гемпротеидов. Существуют два типа билирубина: неконъюгированный (свободный, который с диазореактивом дает непрямую реакцию, т.е. после растворения в этаноле) и конъюгированный (связанный с глюкуроновой кислотой, который сразу реагирует с диазореактивом). По соотношению фракций билирубина судят об изменении пигментного обмена.

 

 

Работа 65. Определение билирубина и его фракций в сыворотке крови

по Йендрашику, Клеггорну и Грофу

 

Реактивы. Кофеиновый реактив^*; хлорид натрия, 9 г/л раствор; диазореактив^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

 

Метод основан на способности связанной и диссоциированной формы свободного билирубина давать при взаимодействии с диазофенилсульфоновой кислотой азобилирубин розовато-фиолетового цвета. Свободный билирубин переводится в растворимое диссоциированное состояние кофеиновым реактивом, благодаря чему в этой пробе определяется общий билирубин. По разнице между общим и связанным билирубином находят концентрацию свободного билирубина.

Ход определения. В три пробирки вносят согласно таблице необходимые ингредиенты и тщательно перемешивают.

 

Реактивы	Общий билирубин, мл	Связанный билирубин, мл	Контроль, мл
Сыворотка	0,50	0,50	0,50
Кофеиновый реактив	1,75	-	1,75
Раствор хлорида натрия	-	1,75	0,25
Диазореактив	0,25	0,25	-

 

При определении общего билирубина пробы оставляют стоять на 20 мин для развития окраски, а связанного – на 5-10 мин (при длительном стоянии в реакцию вступает свободный билирубин).

По истечении указанного времени фотометрируют каждую пробу против воды на ФЭКе при 520-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет. Из полученных экстинкций общего и связанного билирубина вычитают экстинкцию контрольной пробы (контроль на мутность сыворотки) и находят по ним содержание общего и связанного билирубина (в мкмоль/л) по калибровочному графику (рис. 11). Свободный (неконъюгированный) билирубин рассчитывают по разнице между величинами общего и связанного билирубина.

Оформление работы. Рассчитать содержание общего билирубина и его фракций в сыворотке крови и сделать вывод о причине возможных отклонений этих показателей в исследуемом материале.

Практическое значение работы. В норме концентрация общего билирубина в сыворотке крови составляет 8,0-20,0 мкмоль/л; из этого количества 75% приходится на долю неконъюгированного (свободного) билирубина (6,0-15,0 мкмоль/л) и 25% – на долю конъюгированного (связанного) билирубина (2,0-5,0 мкмоль/л). Исследование содержания билирубина проводится в клинике для дифференциальной диагностики желтух. Желтушная окраска кожных покровов проявляется при уровне билирубина в крови выше 27 мкмоль/л. При надпеченочных желтухах (гемолитические анемии, желтуха новорожденных и др.) увеличивается содержание свободного билирубина в крови, при печеночных желтухах, возникающих вследствие поражения собственно клеток печени, повышается концентрация связанного билирубина в крови, а при подпеченочных желтухах, к которым относится механическая, наблюдается возрастание уровня как свободного, так и, в большей степени, связанного билирубина.

 

 

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ПАТОЛОГИЯ

 

Биохимические исследования с целью выявления молекулярных болезней чрезвычайно важны в педиатрии, поскольку своевременная диагностика их помогает раннему лечению с более благоприятным исходом. При ферментопатии блокируется цепь биохимических превращений в тканях, поэтому ранним признаком такого заболевания является накопление в крови и повышенное выделение с мочой веществ, служащих субстратом для поврежденного ферментного белка. В то же время концентрация продуктов данной ферментативной реакции в биологических жидкостях понижена. Поэтому первоначально у больных с подозрением на молекулярную патологию ставят качественную реакцию на вещества, накопления которых ожидают. При положительных пробах проводят их количественное определение. Для уточнения энзимопатии исследуется качественно и количественно соответствующий фермент в сыворотке и клетках крови, а также в биоптатах.