Работа 100. Выявление дыхательной активности микросом

 

Дыхание микросом – процесс окисления веществ кислородом с образованием воды – можно изучать или по скорости потребления кислорода, или по использованию восстановленного НАДФ, или НАД, участвующих в этих реакциях.

Реактивы. Хлорид калия, 1,15%-ный раствор; трис-буфер, 0,1 М раствор с рН 7,4^*; хлорид кальция, 0,04 М раствор; НАДФ·Н, 1,0 мМ раствор, свежеприготовленный; НАД·Н, 1,0 мМ раствор, свежеприготовленный.

Оборудование. Пипетки вместимостью 0,1; 1; 5; 10 мл; штатив с пробирками; стеклянные палочки; чашки Петри; мерный цилиндр вместимостью 25 мл; фильтровальная бумага; шприц с иглой; гомогенизатор с пестиком из тефлона; аптечные весы с разновесами; моторчик для гомогенизации; флуороскоп; центрифуга ЦЛР.

Материал. Печень (свежая) забитого животного.

 

а. Выделение микросомальной фракции из печени крысы. Метод основан на разной скорости осаждения субклеточных частиц печени при центрифугировании в зависимости от их размера и плотности. Для уменьшения фактора осаждения микросом добавляется хлорид кальция, вызывающий их преципитацию.

Ход определения. После забоя животного печень отмывают от крови раствором хлорида калия из шприца, обсушивают ее фильтровальной бумагой и помещают в чашку Петри, стоящую на льду.

3 г ткани печени измельчают ножницами и переносят в стакан гомогенизатора, куда предварительно наливают 9 мл охлажденного раствора хлорида калия. Стакан помещают в лед и размельчают ткань с помощью тефлонового пестика при 1000 об/мин, делая 15-20 движений стаканом вверх-вниз.

Гомогенат разливают в две центрифужные гильзы и центрифугируют на ЦЛР при 10000g в течение 20 мин при 0-4˚С. Надосадочную жидкость сливают в другие центрифужные гильзы, прибавляют к ней раствор хлорида кальция в соотношении 1:5 по объему. Перемешивают и вновь центрифугируют при 3000g в течение 15 мин при 0-4˚С.

Надосадочную жидкость сливают. К осадку, содержащему обогащенную фракцию микросом, добавляют 3 мл раствора трис-буфера и с помощью пипетки, втягивая и выдувая жидкость, получают взвесь микросом.

 

б. Обнаружение дыхательной активности микросом печени флуориметрическим методом. Метод основан на наблюдении за скоростью падения флуоресценции НАДФ·Н или НАД·Н в процессе их окисления препаратами микросом.

Ход определения. В две пробирки наливают по 2,8 мл трис-буфера. Затем в одну из них добавляют 0,1 мл полученной взвеси микросом, а в другую – 0,1 мл дистиллированной воды (контрольная проба).

Ставят обе пробирки в штатив предварительно включенного флуороскопа, вносят в них по 0,1 мл раствора НАДФ·Н или НАД·Н и быстро перемешивают стеклянной палочкой.

Наблюдают за изменением флуоресценции в обеих пробах.

Оформление работы. По изменению флуоресценции указать на наличие дыхательной функции микросом.

Практическое значение работы. Выделение микросом используется в научных исследованиях для изучения их функций, в том числе дыхательной, при различных физиологических состояниях и при патологии, а также для исследования действия лекарств и ядов.

 

 

Работа 101. Исследование окислительного N-деметилирования

В микросомах печени по Нашу

 

Реактивы. Гидроксид натрия, 3%-ный раствор; биуретовый реактив^*; трис-буфер, 0,1 М раствор с рН 7,4^*; НАДФ·Н, 1 мМ раствор, свежеприготовленный; хлорид магния, 2,5 мкМ раствор; амидопирин, 80 мМ раствор; сульфат цинка, 25%-ный раствор; гидроксид бария, насыщенный раствор; реактив Наша^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1; 2 и 5 мл; спектрофотометр.

Материал. Взвесь микросом печени, полученная в работе 85, а.

 

Метод основан на измерении содержания в среде формальдегида, образующегося при окислительном N-деметилировании амидопирина в микросомах:

Формальдегид дает с реактивом Наша комплекс желтого цвета.

Ход определения. Проверяют содержание белка в микросомальной фракции, для чего помещают в пробирку 0,05 мл взвеси микросом, добавляют 3,95 мл раствора гидроксида натрия и 0,2 мл биуретового реактива. Смесь перемешивают и через 30 мин измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной (4 мл раствора NaOH и 0,2 мл биуретового реактива) на СФ при 330 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Экстинкции 0,30-0,60 примерно соответствует содержание белка 2-4 мг в 0,1 мл взвеси микросом. Если экстинкция выше, то необходимо взвесь микросом разбавить трис-буфером так, чтобы получилась нужная концентрация белка.

В опытную и контрольную пробирки вносят по 0,4 мл растворов трис-буфера и хлорида магния, по 0,2 мл НАДФ·Н и по 0,1 мл взвеси микросом. Перемешивают содержимое пробирок.

В опытную пробу добавляют 0,11 мл раствора амидопирина, а в контрольную – сначала по 0,25 мл растворов сульфата цинка и гидроксида бария, а затем 0,11 мл амидопирина. Содержимое перемешивают.

Помещают обе пробирки на 20 мин в водяную баню при 37˚С, периодически встряхивая пробы. По окончании инкубации реакцию в опытной пробе останавливают, добавив по 0,25 мл растворов сульфата цинка и гидроксида бария. Содержимое перемешивают.

Центрифугируют обе пробы при 3000 об/мин в течение 10 мин.

Отбирают по 1 мл надосадочной жидкости в две другие пробирки и приливают в них по 2 мл реактива Наша. Ставят пробы на 45 мин в водяную баню при 37˚С.

Измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на СФ при 412 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет проводят по формуле:

 

аV1,71·333

х = ——————————,

20·0,1·1000

 

где х – скорость N-деметилирования амидопирина, мкмоль/(мин·кг печени);

а – количество формальдегида, найденное по калибровочному графику (рис.12), нмоль;

V – объем взвеси микросом в трис-буфере, мл;

1,71 – объем инкубационной смеси, мл;

0,1 – объем взвеси микросом, взятый на исследование, мл;

20 – время инкубации, мин;

333 – коэффициент пересчета на 1 кг ткани печени;

1000 – коэффициент пересчета нмоль в мкмоль.

Оформление работы. Рассчитать скорость микросомального окисления амидопирина. В выводе указать на значение этого процесса.

Практическое значение работы. Исследование окисления ксенобиотиков монооксигеназной цепью микросом дает возможность оценить функцию этого процесса в норме и патологии, а также изучить особенности превращения различных соединений, токсичность и действие их продуктов на организм.

 

 

Работа 102. Определение гидроксилазной активности

микросом печени по Като и Жилете

 

Реактивы. Трис-HCl буфер, 0,08 М раствор с рН 7,4^*; хлорид магния, 0,16 М раствор; анилин перегнанный, 0,03 М раствор; трихлоруксусная кислота, 15%-ный раствор; карбонат натрия, 10%-ный раствор; фенол, 2%-ный раствор в 0,2 М растворе гидроксида натрия; НАДФ∙Н, 0,03 М раствор; биуретовый реактив^*; гидроксид натрия, 3%-ный раствор; реактивы для выделения микросом, как в работе 86; 4-аминофенол, свежеприготовленный раствор для построения калибровочного графика. (5,45 мг/л).

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 0,2; 1 и 5 мл; водяная баня; лабораторная центрифуга с центрифужными весами; центрифуга рефрижераторная ЦЛР; ФЭК типа КФК-2 или спектрофотометр.

Материал. Печень животного после забоя.

 

Метод основан на определении содержания 4-аминофенола, образующегося при гидроксилировании анилина в монооксигеназной цепи микросом и с участием цитохрома Р₄₅₀:

 

4-аминофенол при взаимодействии с фенолом и в присутствии карбоната натрия образует окрашенный индофенольный комплекс синего цвета:

 

Ход определения. Выделяют фракцию микросом печени, как указано в работе 100, затем определяют содержание белка в полученной микросомальной фракции; для этого отбирают 0,05 мл взвеси микросом в пробирку, добавляют 3,95 мл раствора гидроксида натрия и 0.2 мл биуретового реактива. Перемешивают содержимое стеклянной палочкой и через 30 мин измеряют экстинкцию этого раствора против контрольного (4 мл гидроксида натрия и 0,2 мл биуретового реактива) на ФЭКе и СФ при 330 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Рассчитывают концентрацию белка по калибровочному графику (содержание белка в 0,1 мл взвеси микросом должно составлять примерно 2-4 мг).

Для изучения гидроксилирования анилина берут две чистые пробирки и готовят контрольную и опытную пробы. Последовательность внесения компонентов и их объем приведены в таблице.

 

Контроль	Опыт
вещество	объем	вещество	объем
Трис-HCI буфер	0,4	Трис-HCI буфер	0,4
Хлорид магния	0,4	Хлорид магния	0,4
Взвесь микросом	0,1	НАДФ∙Н	0,2
Трихлоруксусная кислота	0,5	Взвесь микросом	0,1
Анилин	0,11	Анилин	0,11
НАДФ∙Н	0,2

 

Обе пробирки помещают на 20 мин в водяную баню при 37˚С, после чего в опытной пробе останавливают реакцию, приливая 0,5 мл трихлоруксусной кислоты. Далее обе пробы центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

Отбирают из каждой пробы по 1 мл надосадочной жидкости, переносят их в две другие пробирки. Затем приливают к ним по 0,5 мл карбоната натрия и по 1,5 мл раствора фенола. Перемешивают содержимое встряхиванием.

Для развития окраски пробирки помещают на 30 мин в водяную баню при 37˚С. Затем измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на ФЭКе или СФ при 630 нм (светофильтр красный).

Серию растворов для построения калибровочного графика готовят согласно таблице.

 

№ про­бирки	4-амино­фенол, мл	Вода, мл	Nа2СО3, мл	Фенол, мл	Содержание 4-амино­фенола в пробе, нмоль
	0,1	0,9	0,5	1,5	5,0
	0,2	0,8	0,5	1,5	10,0
	0,3	0,7	0,5	1,5	15,0
	0,4	0,6	0,5	1,5	20,0
	0,5	0,5	0,5	1,5	25,0
		1,0	0,5	1,5	0 (контроль)

Затем пробирки ставят на 30 мин в водяную баню при 37˚С. Измеряют экстинкцию проб против контроля, как описано выше, и строят калибровочный график.

Расчет проводят по формуле

 

АV

х = ———,

20m

 

где х – гидроксилазная активность нмоль/(мин∙мг белка);

А – содержание 4-аминофенола в пробе, найденное по калибровочному графику, нмоль;

V – объем пробы, равный 1,71 мл;

20 – время инкубации, мин;

m – содержание белка в пробе, мг.

Практическое значение работы. Для изучения функции микросомальной цепи окисления печени в норме и особенно при патологических состояниях используют различные методические подходы. В частности, исследования проводят с разными субстратами, превращение которых происходит на цитохроме Р₄₅₀. При взаимодействии с цитохромом Р₄₅₀ разные субстраты дают неодинаковые спектры поглощения. По этому признаку их условно делят на субстраты I типа (к ним относятся, например, амидопирин, бензфетамин, этилморфин и др.) и II типа (анилин), что связано, возможно, с некоторыми различиями в механизме гидроксилирования данных соединений.

Скорость реакций гидроксилирования изменяется при действии многих внешних факторов (радиации, гипероксии, гипоксии, интоксикации четыреххлористым углеродом и т.д.), под влиянием ряда регуляторов (витаминов, гормонов). Для получения более полной информации о деятельности гидроксилазной активности микросом печени при действии многих факторов и при патологии используют разные ксенобиотики – субстраты цитохрома Р₄₅₀.

 

 

Работа 103. Метод оценки активности монооксигеназ

эндоплазматической сети клеток печени по выделению метаболитов амидопирина с мочой по Т.А.Попову и О.Д.Леоненко

 

Метаболизм амидопирина осуществляется с помощью ферментативных реакций окисления и конъюгации. Первая из них (N-деметилирование) катализируется монооксигеназной ферментной системой эндоплазматической сети печени по уравнению

Далее 4-аминоантипирин с участием соответствующей N-ацетилтрансферазы и ацетил-КоА подвергается ацетилированию:

 

Реактивы. Фенол перекристаллизованный, 0,02%-ный раствор; аммиачный буфер с рН 10,5-10,6 (20 г хлорида аммония растворяют в 100 мл 25%-ного раствора аммиака); трихлоруксусная кислота, 12,5%-ный раствор; соляная кислота, 36%-ная; гексацианоферрат (III) калия, 1%-ный раствор; 4-аминоантипирин, свежеприготовленный стандартный раствор 1 мг/мл для построения калибровочного графика.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,2; 1; 2 и 5 мл; пробирки, обернутые фольгой; воронки с бумажными фильтрами; воронки со стеклянным мелкопористым фильтром; водяная баня; ФЭК или спектрофотометр.

Материал. Моча, содержащая метаболиты амидопирина. Для получения мочи белым крысам внутрибрюшинно вводят раствор амидопирина из расчета 20 мг на 1 кг массы тела, затем отсаживают их в стеклянные выделительные воронки и собирают мочу в мерные цилиндры в течение 12 или 24 ч. Перед исследованием мочу фильтруют через бумажные фильтры.

 

Метод основан на способности 4-аминоантипирина, являющегося метаболитом амидопирина, при взаимодействии с фенолом в щелочной среде и в присутствии гексацианоферрата (III) калия образовывать соединение типа индофенола, имеющее розовую окраску.

Ход определения. В две пробирки вносят по 1,5 мл профильтрованной мочи. В первую (для определения свободного 4-аминоантипирина) приливают 0,3 мл аммиачного буфера, а во вторую (для определения суммы метаболитов, т.е. 4-аминоантипирина и N-ацетил-4-аминоантипирина) 0,3 мл соляной кислоты. Перемешивают пробы, осторожно встряхивая пробирки.

Содержимое первой пробирки через 15 мин фильтруют через бумажный фильтр; вторую пробирку закрывают пробкой, обернутой фольгой, и помещают на 15 мин в кипящую водяную баню, после чего сразу охлаждают пробу в воде со льдом до комнатной температуры. Охлажденный гидролизат фильтруют через мелкопористый стеклянный фильтр в другую пробирку.

Отбирают из первой пробы 0,6 мл фильтрата в чистую пробирку и добавляют последовательно 0,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты, 2 мл раствора фенола и 0,1 мл раствора гексацианоферрата (III) калия. Содержимое перемешивают и через 10 мин (но не позже чем через час) измеряют экстинкцию опытной пробы на ФЭКе (светофильтр зеленый) или на спектрофотометре при 510 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против контрольной, содержащей все компоненты, кроме фенола, который заменяется 2 мл дистиллированной воды. Полученная экстинкция (Е₁) соответствует содержанию в моче 4-аминоантипирина.

К профильтрованному гидролизату второй пробы приливают 0,6 мл аммиачного буфера, смесь перемешивают и вновь профильтровывают через бумажный фильтр. Отбирают в чистую пробирку 0,8 мл прозрачного фильтрата и добавляют последовательно 0,2 мл дистиллированной воды, 2 мл раствора фенола и 0,1 мл раствора гексацианоферрата (III) калия.

Содержимое пробирки перемешивают и через 10 мин (но не позже чем через час) измеряют экстинкцию второй опытной пробы на ФЭКе или на спектрофотометре при тех же условиях, что и для первой пробы. Полученное значение экстинкции (Е₂) соответствует содержанию в моче суммы метаболитов (4-аминоантипирин и N-ацетил-4-аминоантипирин).

Расчет. Содержание метаболитов амидопирина в моче и показатели активности ферментных систем печени, участвующих в превращении ксенобиотиков, рассчитывают по калибровочному графику. Для его построения в 5 пробирок вносят соответственно 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 и 0,4 мл стандартного раствора 4-аминоантипирина. Затем в каждой пробирке доводят общий объем пробы до 5 мл дистиллированной водой и приливают в них по 1 мл аммиачного буфера. Содержимое перемешивают, фильтруют, отбирают в другие пробирки по 0,6 мл фильтрата и обрабатывают его так же, как и при определении свободного 4-аминоантипирина в моче (первая опытная проба). Полученные значения экстинкции соответствуют концентрации 4-аминоантипирина 5, 10, 20, 30 и 40 мкг/л (примерный калибровочный график показан на рис. 13).

По Е₁ находят общее количество выделенного 4-аминоантипирина, умножая содержание его в пробе на суточный объем мочи (в мл).

По Е₂ определяют аналогичным образом сумму метаболитов амидопирина, выделенных за сутки с мочой.

Относительную активность монооксигеназы печени рассчитывают в % от введенного количества амидопирина по формуле

 

А100%

——————,

В

где А – сумма метаболитов, выделенных с мочой за сутки;

В – количество введенного животному амидопирина.

Ацетилирующую активность ферментных систем организма х (в %) находят по формуле

 

(Е₂ – Е₁)100%

х = ———————,

Е₁

 

где Е₁ и Е₂ – соответствующие экстинкции опытных проб.

Оформление работы. Рассчитать относительную активность ферментных систем N-деметилирования и ацетилирования у исследуемых животных и сделать вывод о практическом значении данного теста.

Практическое значение работы. Обстоятельное изучение ферментов печени, осуществляющих реакции гидроксилирования многих соединений и их конъюгацию, открывает возможности косвенной оценки активности изучения состава и соотношения метаболитов разных ксенобиотиков, поступающих в организм. Демонстративность и относительная простота выполнения позволяют использовать эти тесты не только в эксперименте, но и в клинической практике для выявления ранних нарушений различных токсических веществ, производственных факторов и различных лекарств на ферментативные системы гидроксилирования и ацетилирования ксенобиотиков в организме.

 

 

Работа 104. Определение активности алкогольдегидрогеназы

в сыворотке крови по Шкурски и др. с дополнениями

И.В.Бокия, М.С.Усатенко и В.Ф.Трюфанова

 

Реактивы. Пирофосфатный буфер, 0,1 М раствор, рН 8,5^*; n-нитрозодиметиланилин, 26 мкМ раствор^*; н-бутанол, 0,25 М водный раствор; НАД⁺, свежеприготовленный раствор (3,3 мг НАД в 1 мл 0,25 М раствора бутанола).

Оборудование. Пипетки на 0,1; 1 и 2 мл; стеклянные палочки; секундомер; спектрофотометр.

Материал. Сыворотка крови.

 

Метод основан на способности алкогольдегидрогеназы (АДГ) катализировать две последовательные реакции: НАД-зависимое окисление бутанола и восстановление n-нитрозодиметиланилина с участием НАД∙Н₂, образовавшимся в ходе первой реакции. При этом n-нитрозодиметиланилин, имеющий в растворе интенсивно желтую окраску, обесцвечивается. Об активности АДГ судят по скорости светопоглощения красителя, которое регистрируют на спектрофотометре при 440 нм.

Ход определения. Спектрофотометр подготавливают к работе, устанавливают рабочую длину волны на 440 нм и стрелку шкалы отсчета с помощью рукоятки на «нуль» при закрытой шторке.

В кювету спектрофотометра помещают 2 мл раствора n-нитрозодиметиланилина и 0,5 мл сыворотки крови. Против этой кюветы рукояткой «щель» устанавливают шкалу отсчета на 0,300, после чего реакцию запускают добавлением в кювету 0,1 мл раствора НАД в растворе бутанола. Смесь быстро перемешивают стеклянной палочкой. Регистрируют снижение экстинкции инкубационной среды в течение 2 мин при 25˚С.

 

Примечание. Определение активности АДГ в каждом образце сыворотки проводят дважды, а при расхождении результатов измерения более чем на 10% - три раза. После этого вычисляют среднее значение изменения экстинкции за 1 мин.

 

Расчет производится по формуле

 

х = 320,5∆Е,

 

где х – активность АДГ, мкмоль/(мин∙л);

320,5 – коэффициент расчета активности, выраженный в мкмолях превращенного субстрата при указанных условиях инкубации;

∆Е – изменение экстинкции при 440 нм за 1 мин.

Если изменение экстинкции при 440 нм превышает 0,050 за 1 мин, то сыворотку крови следует развести натрий-фосфатным буфером в 2-4 раза. Измеренную величину активности умножить на фактор разведения.

Для определения активности АДГ рекомендуется брать свежеполученную сыворотку крови. При хранении активность фермента снижается, поэтому значение активности, измеренной после хранения, следует умножить на соответствующий коэффициент, установленный эмпирически:

 

Время хранения сыворотки, сут.
Коэффициент:
при 4˚С	1,00	1,03	1,04	1,09	1,11	1,12	1,15	1,17
при 20˚С	1,00	1,18	1,20	1,43	1,47	1,54	1,66	2,38

 

Оформление работы. Сравнить полученное значение активности АДГ с нормой и сделать соответствующие выводы.

Практическое значение работы. Алкогольдегидрогеназа не проявляет абсолютной субстратной специфичности. Этот фермент катализирует окисление, помимо этанола, ряда первичных и вторичных спиртов, этиленгликоля и т.д., причем в некоторых случаях с большей скоростью, чем этанола. АДГ содержится в гиалоплазме клеток многих органов и тканей, но в ткани печени ее активность в 20-40 раз выше, чем в других. В сыворотке крови концентрация фермента у здоровых людей очень низка и традиционными методами практически не выявляется. Описанный метод позволяет определить активность АДГ. У здоровых людей активность АДГ в сыворотке крови регистрируется в пределах 0,32-2,56, а в среднем 1,18 мкмоль/мин∙л. У лиц, злоупотребляющих алкоголем, активность фермента в сыворотке крови повышается в зависимости от длительности приема алкоголя и стадии алкоголизма. Тест на алкогольдегидрогеназу сыворотки крови используется в диагностике алкоголизма и контроля эффективности лечения этого заболевания.

Низкая активность АДГ при поражениях печени, в которой окисляется до 90% поступающего в организм этанола и других спиртов, или генетическая недостаточность этого фермента снижает обезвреживание алкоголя и усугубляет его отрицательное действие на функции систем организма.

 

 

Работа 105. Определение ацетилирующей способности организма

по выделению с мочой свободной и ацетилированной форм

сульфаниламидов по А.М.Тимофеевой в модификации Г.А.Пономарева

 

Процесс ацетилирования является одной из разновидностей реакций конъюгации ксенобиотиков, происходящих в клетках с участием ферментов. Ариламины, в том числе сульфаниламиды, подвергаются N-ацетилированию в организме и поэтому по выделению свободной и ацетилированной форм этих веществ можно оценить активность процесса ацетилирования.

 

Реактивы. Соляная кислота, 10%-ный раствор; нитрит натрия, 0,5%-ный раствор, свежеприготовленный; ацетат натрия, насыщенный раствор; Н-кислота ацетилированная, свежеприготовленный 0,5%-ный раствор.

Оборудование. Водяная баня; штатив с пробирками; пробки, обернутые фольгой; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; ФЭК.

Материал. Моча, содержащая свободный и ацетилированный сульфаниламиды. (Для получения мочи белым крысам вводят внутрижелудочно с помощью зонда порошок сульфадимезина из расчета 0,5 г на 1 кг массы тела в виде взвеси в 3 мл воды. Животных отсаживают на сутки в стеклянные выделительные воронки для сбора мочи. Собранную мочу доводят дистиллированной водой до объема 25 мл и фильтруют через бумажный фильтр).

 

Метод основан на способности диазотированного сульфаниламида при взаимодействии с ацетилированной Н-кислотой (1,6-аминооксинафталин-3,5-дисульфокислота) образовывать комплекс розового цвета, интенсивность которого пропорциональна концентрации сульфаниламида.

Содержание суммы сульфаниламидов (ацетилированных и свободных) в моче устанавливают после гидролиза проб с соляной кислотой, в ходе которого происходит образование свободной формы сульфаниламида из ацетилированной.

Ход определения. В две пробирки (одна для определения общего, а другая – свободного сульфадимезина) отмеривают по 1 мл разведенной в 20 раз мочи, по 1,5 мл дистиллированной воды и по 0,25 мл раствора соляной кислоты. В третью пробирку (контрольная) вносят 2,5 мл воды и 0,25 мл раствора соляной кислоты.

Одну пробирку (для определения общего сульфадимезина) закрывают пробкой, обернутой фольгой, и ставят на гидролиз в кипящую водяную баню на 15 мин. Затем пробирку охлаждают.

Во все три пробирки приливают по 2 капли раствора нитрита натрия, тщательно перемешивают содержимое и оставляют стоять 10 мин. Добавляют во все пробы по 1,5 мл насыщенного раствора ацетата натрия, закрывают пробирки пробками и энергично встряхивают их несколько раз.

Прибавляют во все пробирки по 0,25 мл раствора ацетилированной Н-кислоты. Вновь перемешивают содержимое и оставляют стоять пробы на 15 мин для развития окрашивания.

Измеряют экстинкцию опытных проб против контроля на ФЭКе при 440 нм (светофильтр синий) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет проводят по формуле

 

(Е₂ – Е₁)100

х = ———————,

Е₂

 

где х – ацетилирующая способность организма, % ацетилированного сульфадимезина

Е₁ – экстинкция свободного сульфадимезина, содержащегося в пробе, не подвергшейся гидролизу;

Е₂ – экстинкция общего сульфадимезина (свободный + ацетилированный), содержащегося в пробе, подвергнутой гидролизу.

Оформление работы. Занести значения экстинкции в тетрадь и рассчитать ацетилирующую способность организма по сульфадимезину. Сделать вывод о возможности метаболизма ксенобиотиков посредством ацетилирования и значении этого процесса.

Практическое значение работы. По степени ацетилирования сульфаниламидов или других ксенобиотиков, подвергающихся в организме ацетилированию, судят об активности ферментной системы ариламинацетилтрансферазы в клетках, которая катализирует реакции ацетилирования (конъюгации) различных соединений. Для сульфаниламидов реакция ацетилирования является основным ведущим механизмом конъюгации, другие конъюгаты для большинства сульфаниламидов образуются в незначительном количестве. Ацетилирование приводит к инактивации (обезвреживанию) сульфаниламидов и выведению их из организма с мочой. Поэтому степень ацетилирования сульфаниламидов указывает также на соотношение бактериостатически активной и неактивной форм препаратов. Чем быстрее ацетилируется сульфаниламид, тем меньше его бактериостатическая активность

 

 

Работа 106. Выявление ацетилирования (инактивации) гидразида

изоникотиновой кислоты (ГИНК) в организме

 

Реактивы. Реактив метаванадата аммония^*; соляная кислота, 0,5 М раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пробки, обернутые фольгой; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; водяная баня.

Материал. Моча, содержащая свободную и ацетилированную формы ГИНК. (Для получения мочи белым крысам вводят порошок ГИНК в дозе 100 мг на 1 кг массы тела в виде взвеси в 3 мл воды через рот с помощью специального зонда. Крыс отсаживают на 12 ч в стеклянные выделительные воронки для сбора мочи. Объем мочи доводят водой до 10 мл и фильтруют через бумажный фильтр).

 

Метод основан на выявлении свободной формы ГИНК, которая с метаванадатом аммония в кислой среде дает комплексное соединение коричнево-красного цвета. Разница в окраске между пробами мочи до и после гидролиза указывает на степень ацетилирования ГИНК в организме:

 

Ход определения. Собранную мочу разводят в 20 раз дистиллированной водой. В две пробирки вносят по 1 мл разведенной мочи; в одну из них (для определения общей ГИНК, т.е. суммы свободной и ацетилированной форм препарата) добавляют 1 мл раствора соляной кислоты, а во вторую (для выявления свободной ГИНК) – 1 мл дистиллированной воды.

Первую пробирку закрывают пробкой и ставят на 20 мин на кипящую водяную баню, после чего охлаждают под струей водопроводной воды. В обе пробирки приливают по 2 мл реактива метаванадата аммония и отмечают разницу в окрашивании исследуемых проб мочи.

Оформление работы. По разнице в окраске проб мочи дать примерную оценку степени ацетилирования ГИНК в организме и указать на значение этой реакции для практики.

Практическое значение работы. Реакция N-ацетилирования ГИНК осуществляется специальной ацетилтрансферазой, содержащейся в различных тканях организма. В зависимости от активности этого фермента у разных людей их делят на быстрых и медленных «инактиваторов» (ацетиляторов) ГИНК, что имеет значение не только для практической фармакогенетики, но и для рациональной терапии. По степени ацетилирования ГИНК устанавливается эффективная индивидуальная доза препарата для конкретного больного.