Работа 66. Выявление гипераминоацидурии

 

Реактивы. Нингидрин, 0,5%-ный раствор в ацетоне с добавлением 1 мл концентрированной уксусной кислоты на 100 мл жидкости; глицин, стандартный 20 мМ раствор.

Оборудование. Полоски фильтровальной бумаги 10х40 мм; сушильный шкаф, отрегулированный на 60˚С; глазные пипетки.

Материал. Моча, нормальная и патологическая^*.

Принцип метода см. работу 1, б.

Ход определения. В трех пробирках готовят серию разведений стандартного раствора глицина в 2,5 и 10 раз, при этом концентрация азота глицина в пробах составляет соответственно 10,4 и 2 ммоль/л.

На две полоски фильтровальной бумаги наносят по 1 капле соответственно нормальной и патологической мочи, а еще на четыре – по 1 капле неразведенного и разведенного в 2,5 и 10 раз стандартного раствора глицина. Пятна подсушивают на воздухе.

На высушенные пятна наносят по 1-2 капли раствора нингидрина, подсушивают на воздухе и затем помещают полоски на 15 мин в сушильный шкаф при 60˚С, подвешивая их на крючках.

Сравнивают интенсивность окраски проб нормальной и патологической мочи с окраской глицина на полосках фильтровальной бумаги. Цветная шкала соответствует следующим концентрациям глицина: 20. 10, 4, 2 ммоль/л.

Оформление работы. Оценить примерное содержание азота аминокислот в нормальной и патологической моче. Сделать вывод о наличии гипераминоацидурии у больного ребенка и указать возможные ее причины.

Практическое значение работы. В норме экскреция азота аминокислот составляет 0,29-5,35 ммоль/сут. У ребенка его выделяется 0,07-0,15 ммоль/кг массы тела в сутки, причем 2/3-3/4 этого количества экскретируется в ночное время. Гипераминоацидурия наблюдается при молекулярных болезнях, возникающих вследствие дефекта белков эпителия канальцев почек, переносящих аминокислоты и способствующих их реабсорбции, или в результате нарушения обмена аминокислот в тканях. Окончательно наследственная причина гипераминоацидурии устанавливается после исключения ряда заболеваний (цирроз печени, гепатиты, дистрофия, рахит и т.д.), тоже приводящих к повышенному выделению аминокислот с мочой.

 

 

Работа 67. Экспресс-методы диагностики фенилкетонурии

 

Фенилкетонурия, или фенилпировиноградная олигофрения, связана с дефектом фермента фенилаланингидроксилазы, вследствие чего нарушается превращение фенилаланина в тирозин. При этом увеличивается содержание фенилаланина и продуктов его обмена (в частности, фенилпировиноградной кислоты) в крови и моче.

 

Реактивы. Фенилаланин, стандартный раствор 0,06 г/л; растворитель (бутанол, уксусная кислота и вода в соотношении 15:15:10); нингидрин, 0,5%-ный раствор в ацетоне; хлорид железа (III), 10%-ный раствор; набор «Биофан П» (ГДР), содержащий индикаторную бумагу с цветной шкалой.

Оборудование. Хроматографическая бумага 11х11; микропипетки; чашка Петри; ножницы; сушильный шкаф, отрегулированный на 90-100˚С; фильтровальная бумага; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 мл; глазные пипетки.

 

Материал.

1. Моча, нормальная и патологическая, содержащая фенилпировиноградную кислоту.

2. Плазма крови здорового и больного человека с повышенным содержанием фенилаланина.

 

а. Экспресс-определение фенилаланина в плазме крови методом бумажной радиальной хроматографии. Метод основан на различной скорости передвижения фенилаланина по хроматографической бумаге вследствие разности коэффициентов распределения его между неподвижной и подвижной фазами растворителя. Положение аминокислот на хроматограмме, которая представлена в виде концентрических кругов, выявляется нингидриновой реакцией.

Ход определения. Складывают квадрат хроматографической бумаги вчетверо и делают вырез в центре его диаметром около 1 см.

Квадрат хроматографической бумаги простым карандашом делят на секторы, нумеруют их от 1 до 4, отступив от центра выреза на 1 см, и намечают карандашом в каждом секторе кружки для нанесения проб. Помещают квадрат на ножку, сделанную из фильтровальной бумаги в виде трубочки высотой 2 см и вставленную в центральный вырез.

Наносят микропипеткой в обведенный кружок 1-го сектора 0,02 мл стандартного раствора фенилаланина, затем подсушивают пятно с помощью вентилятора и на высушенное место наносят 0,02 мл плазмы крови здорового человека; в кружок 2-го сектора наносят 0,02 мл плазмы здорового человека и 3–й сектор – 0,02 мл плазмы обследуемого больного пациента. Оставляют бумагу на воздухе до полного высыхания нанесенных проб.

В чашку Петри наливают растворитель, кладут бумажный квадрат на края чашки Петри, при этом конец ножки погружается в растворитель. Закрывают чашку крышкой и оставляют при комнатной температуре, пока фронт растворителя не достигает диаметра около 5 см (отметку карандашом сделать заранее). После этого хроматограмму высушивают в сушильном шкафу при 90-100˚С, опрыскивают ее раствором нингидрина и вновь помещают в сушильный шкаф на 10 мин.

В отрицательных пробах (содержание фенилаланина ниже 0,07 г/л) окрашивается пятно нанесенной плазмы и небольшая окружающая часть. Пятно со стандартным раствором фенилаланина (0,06 г/л) и плазмой здорового человека (0,01 г/л) содержит в сумме 0,07 г/л фенилаланина. Исследуемые образцы, дающие такой же или больший ореол, считают положительными. В пробах, взятых у больных фенилкетонурией, обнаруживается четкий ореол диаметром около 3,5 см.

Оформление работы. Зарисовать полученную хроматограмму, сравнить величину окрашенных зон в трех секторах и сделать вывод относительно изменений у больного пациента.

б. Обнаружение фенилпировиноградной кислоты в моче. Метод основан на взаимодействии енольной формы фенилпировиноградной кислоты с хлоридом железа FeCl₃ с образованием комплексного соединения сине-зеленого цвета.

Ход определения. В одну пробирку наливают 0,5 мл мочи здорового, а в другую – больного человека, добавляют по 5 капель раствора хлорида железа (III) и наблюдают за появлением окрашивания.

Эту реакцию дают различные вещества, хотя окраска их соединений с хлоридом железа FeCl₃ неодинакова. При наличии в моче достаточных количеств фенилпировиноградной кислоты развивается сине-зеленое или темно-зеленое окрашивание, исчезающее через 5-10 мин. Сходное окрашивание может давать билирубин мочи.