Работа 92. Тимоловая проба по Хуэрго и Поппер

 

Реактивы. 10%-ный спиртовой раствор тимола^*; буферный раствор^*; тимолововероналовый буфер^*; стандартный раствор^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки на 0,2 и 10 мл; фотоэлектроколориметр.

Материал. Исследуемая сыворотка крови.

 

Метод основан на взаимодействии белков сыворотки крови с тимолово-вероналовым буфером, при этом появляется мутность вследствие образования глобулино-тимоло-фосфолипидного комплекса.

Ход определения. К 6,0 мл тимолово-вероналового буферного раствора прибавляют 0,1 мл негемолизированной сыворотки, оставляют стоять 30 минут, затем фотометрируют при 660 нм против буферного раствора в кюветах с толщиной 10 мм. Реакцию проводят при температуре +25˚С. Расчет ведут по калибровочной кривой.

 

Примечание. Для получения точных данных важным является взятие крови натощак: алиментарная гиперлипемия существенно влияет на результаты исследования. При постановке пробы может использоваться сыворотка, хранившаяся в течение нескольких дней. Умеренный гемолиз не отражается на результатах исследования.

 

Расчет. По полученной величине экстинкции по калибровочному графику проводят определение величины тимоловой пробы.

Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора готовят разведение, соответствующее единицам помутнения по S-H. Так, 1,35 мл суспензии и 4,65 мл 0,2 н серной кислоты соответствует 5 S-H помутнения; 2,70 мл суспензии и 3,30 мл кислоты – 10 S-H; 5,40 мл суспензии и 0,60 мл кислоты – 20 S-H помутнения.

Разведения смешивают, хорошо встряхивают и фотометрируют при длине волны 660 нм (630-690 нм – красный светофильтр) против воды в кюветах на 10 мм. По полученным данным строят калибровочную кривую

Оформление работы. После определения величины тимоловой пробы по полученным данным сделать вывод о возможных изменениях и причинах их отклонений.

Практическое значение работы. В норме составляет 0-4 ед (SH). Тимоловая проба более пригодна для функционального исследования печени. Она положительна при болезни Боткина, при токсическом гепатите, коллагеновых заболеваниях, малярии и вирусных инфекциях. При механической желтухе проба отрицательна, что имеет дифференциально-диагностическое значение.

 

 

Работа 93. Сулемово-осадочная реакция

(сулемовая проба по Гринседту).

 

Реактивы. 0,1% раствор сулемы (готовят из кристаллической сулемы, растворяя соль в горячей дистиллированной воде); 0,85% раствор хлорида натрия.

Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки на 1,0 и 2,0 мл.

Материал. Исследуемая сыворотка крови.

Метод основан на способности сулемы образовывать с мелкодисперсными белками коллоидный раствор солей ртути. Нарушение дисперсности белковых фракций сыворотки крови вызывает осаждение грубодисперсных частиц.

Ход определения. К 0,5 мл негемолизированной сыворотки крови добавляют 1 мл физиологического раствора и титруют 0,1% раствором сулемы из микробюретки или пипетки емкостью 2 мл. В начале раствор приливают по каплям в быстрой последовательности до первоначального образования помутнения, затем медленно до появления стойкого помутнения. Результаты сулемовой реакции выражают количеством мл раствора сулемы, израсходованного на титрование.

Расчет. Проводят на основании количества сулемы, пошедшей на титрование исследуемой пробы.

Оформление работы. После определения величины сулемовой пробы по полученным данным сделать вывод о возможных изменениях и причинах их отклонений.

Практическое значение работы. В норме у здоровых людей на титрование идет 1,6-2,2 мл сулемы.

Положительная проба встречается при ряде патологических состояний: заболеваниях печени (при болезни Боткина сулемовая проба составляет около 1 мл, приходя к норме при выздоровлении), хроническом нефрите, нефрозе, пневмонии, туберкулезе легких, миеломе, инфекционных заболеваниях и т.д.

 

 

Работа 94. Количественное определение содержания железа

в сыворотке крови

 

Реактивы. Трихлоруксусная кислота, 20% раствор; уксуснокислый аммоний, 70% раствор; насыщенный раствор сульфата гидразина (2,5 г соли растворяют в 100 мл воды); раствор батофенантролина^*; стандартный раствор^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью на 1,0; 2,0 и 5,0 мл; водяная баня на 100˚С; центрифуга лабораторная; фотоколориметр.

Материал. Сыворотка, не содержащая следов гемолиза.

 

Метод основан на способности бато-фенантролина в сульфатированной форме образовывать с ионами двухвалентного железа окрашенный комплекс, интенсивность которого определяется фотометрически.

Ход определения. К 2 мл исследуемой сыворотки прибавляют 2,5 мл воды, 1,5 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и ставят на 15 минут на водяную баню при температуре 90-95˚С. Центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин и отбирают 4 мл надосадочной жидкости, к которой добавляют 0,35 мл 70% раствора ацетата аммония и 0,3 мл раствора сульфата гидразина. Смесь фотометрируют при длине волны 535 нм в кювете 10 мм. Затем добавляют 0,4 мл раствора сульфонированного бато-фенантролина, оставляют стоять на 1 час, после чего фотометрируют при тех же условиях. Фотометрию проводят против контрольной пробы, в которую вместо исследуемой сыворотки вносят 2 мл воды.

Калибровку проводят так же как и основной опыт, но вместо сыворотки берут 2 мл стандартного раствора.

Расчет проводят по формуле:

 

Е_оп-1 – Е_оп-2

——————— ∙30 (мкмоль/л)

Е_к-1 – Е_к-2

 

где Е_оп-1 и Е_оп-2 – экстинкции опытной пробы до и после прибавления раствора бато-фенантролина;

Е_к-1 – Е_к-2 – результаты фотометрии калибровочной пробы;

30 – содержание железа в калибровочном растворе, мкмоль/л.

 

Примечание.

1. Железо определяется в сыворотке без следов гемолиза.

2. Следить за содержанием в дистиллированной воде и реактивах, лучше использовать бидистиллированную воду.

3. Посуду следует промывать 5н раствором соляной кислоты и ополаскивать бидистиллированной водой.

4. При взятии крови на анализ больной не должен принимать препаратов железа по меньшей мере в течение 5 дней.

 

Оформление работы. Рассчитать содержание железа по представленной формуле и сделать вывод его в соответствии норме.

Практическое значение работы. В норме содержание негеминового железа у мужчин 12-32 мкмоль/л, у женщин – на 10-15% ниже.

Содержание железа сыворотки значительно снижается при железодефицитной анемии, независимо от причины ее вызывающей. При воспалительных, инфекционных, септических состояниях, интоксикации, опухолях анемии обусловлены не столько дефицитом железа, сколько его недостаточным освобождением из РЭС, вследствие чего снижается синтез гемоглобина.