Заглавная страница Избранные статьи Случайная статья Познавательные статьи Новые добавления Обратная связь КАТЕГОРИИ: АрхеологияБиология Генетика География Информатика История Логика Маркетинг Математика Менеджмент Механика Педагогика Религия Социология Технологии Физика Философия Финансы Химия Экология ТОП 10 на сайте Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрацииТехника нижней прямой подачи мяча. Франко-прусская война (причины и последствия) Организация работы процедурного кабинета Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний Коммуникативные барьеры и пути их преодоления Обработка изделий медицинского назначения многократного применения Образцы текста публицистического стиля Четыре типа изменения баланса Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву Мы поможем в написании ваших работ! ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?
Влияние общества на человека
Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации Практические работы по географии для 6 класса Организация работы процедурного кабинета Изменения в неживой природе осенью Уборка процедурного кабинета Сольфеджио. Все правила по сольфеджио Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления |
Работа 44. Качественные реакции на пигменты растений
Реактивы. Этанол, 96%-ный; бензин; гидроксид бария, насыщенный раствор; аскорбиновая кислота, кристаллическая; соляная кислота, 10%-ный раствор. Оборудование. Водяная баня с лабораторным термометром; штатив с пробирками; капельницы; пипетки вместимостью 5 мл; аптечные весы с разновесками; ступка с пестиком. Материал. Листья крапивы, сушеные.
а. Экстрагирование пигментов из листьев крапивы. Метод основан на способности хлорофилла и других пигментов под действием горячего спирта переходить в раствор, при этом хлорофилл при взаимодействии со спиртом превращается в этилхлорофиллид – сложный эфир, в котором остаток фитола замещен остатком этилового спирта. Ход определения. 0,5 г сушеной крапивы растирают в ступке с 5,0 мл этилового спирта, переносят в пробирку и нагревают на водяной бане при 90-100˚С до закипания спирта. Содержимое фильтруют через бумажный фильтр в другую пробирку. Фильтрат, содержащий хлорофиллид, ксантофилл и другие пигменты, имеет зеленый цвет с интенсивной красной флюоресценцией. Его используют для исследования. б. Разделение пигментов по Краусу. Метод основан на различной способности пигментов растворяться в бензине: хлорофилл, хлорофиллид растворимы, а ксантофилл нерастворим в нем. Ход определения. К 10 каплям полученного фильтрата прибавляют равный объем бензина, содержимое тщательно встряхивают, постукивая пальцем по дну пробирки. Наблюдают за окраской пигментов, содержащихся в разных растворителях. в. Осаждение хлорофилла. Метод основан на способности эфирных групп при омылении раствором гидроксида бария образовывать бариевые соли хлорофиллидов А и В, нерастворимых в воде; жидкость над осадком имеет желтую окраску вследствие присутствия в вытяжке каротина и ксантофилла. Ход определения. К 10 каплям фильтрата добавляют 20 капель раствора гидроксида бария и тщательно взбалтывают. Наблюдают за происходящими изменениями. г. Восстановление хлорофилла аскорбиновой кислотой. Метод основан на способности аскорбиновой кислоты восстанавливать хлорофилл, приобретающий вследствие этого желтое окрашивание. Ход определения. К 10 каплям фильтрата добавляют 2 капли воды, несколько кристалликов аскорбиновой кислоты и в течение 3-5 мин нагревают в водяной бане при 70-80˚С. Наблюдают за изменением окраски.
д. Получение феофитина из хлорофилла. Метод основан на способности соляной кислоты связывать ион магния, входящий в состав хлорофилла, с образованием феофитина, имеющего оливково-бурый цвет. Ход определения. К 5 каплям фильтрата прибавляют 1 каплю раствора соляной кислоты. Наблюдают за изменением окраски. Оформление работы. Дать оценку качественным реакциям на пигменты растений. В выводах обосновать значение хлорофилла и других пигментов для фотосинтетических процессов. Практическое значение работы. Методы разделения и анализа пигментов фотосинтетического аппарата растений используются для изучения физико-химических свойств, фотохимической активности и характеристики их состава на разных стадиях онтогенеза растений и влияния на него факторов внешней среды.
Работа 45. Определение активности пероксидазы в растительном материале по методу А.Н.Бояркина
Реактивы. Ацетатный буфер, 0,1 М раствор с рН 5,4*; пероксид водорода, 0,03%-ный раствор; бензидин, 0,92 г/л раствор на ацетатном буфере*. Оборудование. Колбы вместимостью 25 мл; пипетки вместимостью 5 мл; центрифуга лабораторная с центрифужными весами; ФЭК. Материал. Листья растений, свежие.
Метод основан на непрерывном измерении светопоглощения бензидиновой сини, образующейся при окислении бензидина под действием пероксидазы. Реакция описывается уравнением.
Ход определения. Навеску 100 мг растительного материала помещают в ступку и растирают, прибавляя порциями 10 мл дистиллированной воды. Растертую массу переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки. Содержимое колбы настаивают 10 мин, затем сливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Для определения активности фермента берут кювету с толщиной слоя 2 см и наливают в нее по 2 мл водной вытяжки из листьев, ацетатного буфера и раствора бензидина. Ставят кювету в кюветодержатель и устанавливают стрелку прибора на нулевую отметку, затем добавляют 2 мл раствора пероксида водорода пипеткой с широким носиком (чтобы сильная струя перемешала жидкость в кювете) и одновременно с добавлением пероксида включают секундомер. Раствор в кювете начинает синеть и по мере нарастания интенсивности окраски стрелка прибора отклоняется. Отмечают время от начала приливания раствора пероксида водорода до достижения стрелкой гальванометра отметки 0,250. Повторяют определение трижды и берут среднее значение времени.
Расчет. Активность фермента рассчитывают по формуле
∆Е 25∙1000 х = ————————, t∙d 0,1∙2
где х – активность пероксидазы, Е∙с-1∙кг-1 (Е – единица экстинкции); ∆Е – изменение экстинкции, равное 0,250; t – время реакции, с; d – толщина слоя кюветы, равная 2; 1000 – коэффициент пересчета граммов в килограммы; 0,1 – навеска, г; 2 – объем пробы, мл.
После сокращений формула принимает вид
х = ————— t
Оформление работы. Рассчитать и сравнить активность пероксидазы в исследуемом материале; в выводе отметить биологическое значение фермента. Практическое значение работы. Пероксидаза выполняет две функции: собственно пероксидазную, т.е. окисляет вещества с участием пероксида водорода, и оксидазную, т.е. катализирует окисление субстратов за счет молекулярного кислорода без участия пероксида водорода. Этот фермент проявляет перокисдазную активность в отношении практически всех фенолов (пирокатехин, пирогаллол, галловая кислота, гваякол и др.), ароматических аминов (бензидин, n-фенилендиамин и др.), аскорбиновой кислоты, нитритов и т.д. В то же время пероксидаза, обладая оксидазной функцией, способна участвовать в окислении флороглюцина, НАД∙Н2, НАДФ∙Н2, индолилуксусной кислоты, оксалата, фенилпирувата и т.д. В практике широко используют определение активности пероксидазы для оценки метаболизма ростовых веществ, лигнина и других вторичных продуктов обмена при физиологических и патологических процессах. Пероксидаза, выделенная из хрена, широко используется как аналитический реагент при проведении клинико-биохимических исследований. Поэтому метод измерения активности фермента необходим для контроля качества продажного препарата фермента.
ОБМЕН УГЛЕВОДОВ
Методы исследования обмена углеводов необходимы для диагностики сахарного диабета и других эндокринных заболеваний, энзимопатий, функции печени, почек и т.д. Одним из информативных показателей состояния углеводного обмена является уровень глюкозы в крови, исследование которого чаще всего проводится в клинике. Реже прибегают к изучению содержания других сахаров и гликогена, а также к определению концентрации молочной и пировиноградной кислот. При наследственных нарушениях метаболизма углеводов известную диагностическую ценность представляет определение активности участвующих в нем ферментов.
Работа 46. Определение содержания глюкозы в крови о-толуидиновым методом
Реактивы. Трихлоруксусная кислота, 30 г/л раствор; о-толуидиновый реактив*; глюкоза, основной стандартный 27,8 мМ раствор, свежеприготовленный. Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1, 1 и 5 мл; водяная баня; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК. Материал. Кровь, взятая из пальца.
Метод основан на способности глюкозы при нагревании с о-толуидином в растворе уксусной кислоты давать зеленое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации глюкозы.
Ход определения. В центрифужную пробирку отмеряют 0,9 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Из пальца обследуемого берут микропипеткой 0,1 мл крови и выдувают в пробирку с трихлоруксусной кислотой. Смесь в пробирке перемешивают встряхиванием и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Отбирают 0,5 мл центрифугута в другую пробирку и добавляют в нее 2 мл о-толуидинового реактива. Пробирку помещают в кипящую водяную баню на 8 мин, после чего охлаждают под струей холодной воды. Для постановки стандартной пробы вместо крови берут 0,1 мл разведенного в 5 раз стандартного раствора глюкозы, добавляют 0,9 мл раствора трихлоруксусной кислоты и с 0,5 мл полученной смеси проводят реакцию с о-толуидиновым реактивом. Фотометрируют опытную и стандартные пробы на ФЭКе при 590-650 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см в сравнении с дистиллированной водой. Расчет. Содержание глюкозы в крови х (моль/л) рассчитывают по формуле Еоп Сст х = —————, Ест
где Еоп – экстинкция опыта, Ест – экстинкция стандарта; Сст – концентрация глюкозы в стандартной пробе, равная 5,55 ммоль/л. Оформление работы. Рассчитать концентрацию глюкозы в крови обследуемого и сделать вывод о причинах возможных изменений ее уровня. Практическое значение работы. Методы, применяемые для определения глюкозы, не всегда дают истинное содержание ее в крови, поэтому существуют понятия – «истинная» глюкоза и сахар крови. Последний показатель включает всю сумму восстанавливающих углеводов и некоторые редуцирующие вещества неуглеводной природы (глутатион, креатин, мочевая кислота). Поэтому содержание сахара в крови выше, чем показатель истинной глюкозы. Среди методов, позволяющих определить концентрацию истинной глюкозы в биологическом материале, следует отметить о-толуидиновый и глюкозооксидазный. В норме содержание сахара в крови составляет 0,8-1,2 г/л, а глюкозы – 2,8-4,0 ммоль/л. Увеличение уровня сахара в крови (гипергликемия) наблюдается при сахарном диабете, при избытке в организме глюкокортикоидов – гормонов коры надпочечников, при стрессовых состояниях, при употреблении с пищей большого количества углеводов и т.д. Низкое содержание сахара в крови (гипогликемия) имеет место при голодании, нарушении всасывания глюкозы в тонком кишечнике (малосорбция), при избытке инсулина в организме (гиперинсулинизм) и т.д.
Работа 47. Количественное определение содержания глюкозы в крови глюкозооксидазным методом
Реактивы. 5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; натрий фосфат двузамещенный, 0,25 моль/л*; раствор глюкозооксидазы*; фенолфталин 0,5%; рабочий реактив*. Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1,0; 2,0 мл; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК. Материал. Кровь, взятая из пальца.
Метод основан на способности глюкозооксидазы при определенном оптимуме рН действия катализировать распад глюкозы с образованием перекиси водорода. Образующаяся перекись водорода в присутствии ионов меди окисляет фенолфталин до фенолфталеина, который в нейтральной области бесцветен, а в щелочной области окрашен в красный цвет. Ход определения. 0,03 мл крови выливают в 1,5 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и центрифугируют. К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 2 мл 0,25 моль/л фосфата натрия и 2 капли (приблизительно 0,1 мл) раствора глюкозооксидазы. Перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре на 1 час, затем добавляют 2 мл рабочего реактива и через 30 мин фотометрируют в кювете на 10 мм при длине волны 530 нм (зеленый светофильтр). Одновременно ставят контрольную пробу, в которую берут 1 мл 5% раствора трихлоруксусной кислоты и далее проводят как и опытную пробу. Расчет. Расчет проводят по калибровочному графику. Оформление работы. По экстинкции рассчитывают содержание глюкозы в крови, сравнивают ее содержание с нормой и делают вывод о возможных отклонениях. Практическое значение работы. (См. определение содержания глюкозы в крови орто-толуидиновым методом).
Работа 48. Определение содержания молочной кислоты в крови по Баркеру и Саммерсону
Реактивы. Трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор; сульфат меди (II), 20%-ный и 4%-ный растворы; оксид кальция, порошок, навеска 0,5 г; серная кислота, конц.; n-гидроксидифенил, свежеприготовленный щелочной раствор (50 мг n-гидроксидифенила растворяют в 3 мл 3%-ного раствора гидроксида натрия). Оборудование. Водяная баня с лабораторным термометром; штатив с пробирками; пипетки на 0,1 и 1 мл; стеклянные палочки; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК. Материал. Кровь, взятая из пальца.
Метод основан на способности молочной кислоты при нагревании с концентрированной серной кислотой переходить в ацетальдегид, дающий с n-гидроксидифенилом характерную фиолетовую окраску, интенсивность которой пропорциональна концентрации молочной кислоты:
Ход определения. В центрифужную пробирку отмеривают 0,5 мл дистиллированной воды и вносят в нее 0,1 мл крови, взятой микропипеткой из пальца обследуемого. Микропипетку промывают той же водой. К содержимому пробирки добавляют 1 мл раствора уксусной кислоты и помещают ее на 10 мин в лед (для лучшего осаждения белков), после чего центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин.
Надосадочную жидкость сливают в чистую центрифужную пробирку, добавляют 0,5 мл 20%-ного раствора сульфата меди и 0,5 г порошка оксида кальция и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Появляется голубое окрашивание (если окрашивание зеленоватое, то проба дальнейшей обработке не подвергается). Смесь оставляют стоять на 30 мин, периодически помешивая стеклянной палочкой. Затем ее центрифугируют 5 мин при 100 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в чистую пробирку, приливают 1 каплю 4%-ного сульфата меди и осторожно наслаивают 3 мл концентрированной серной кислоты, погрузив при этом пробирку в лед и непрерывно помешивая содержимое стеклянной палочкой. После этого пробирку помещают в кипящую водяную баню на 5 мин и затем охлаждают ее в водяной бане до 20˚С. К охлажденной смеси приливают 1 каплю (0,05 мл щелочного раствора n-гидроксидифенила и ставят пробирку в водяную баню при 30˚С на 30 мин, время от времени взбалтывая содержимое. В пробирке за это время развивается голубое окрашивание. Пробирку помещают на 90 с (точно!) в бурно кипящую водяную баню. За это время голубая окраска переходит в фиолетовую. Затем смесь охлаждают и фотометрируют на ФЭКе при 540 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1,0 см против воды. Расчет. Содержание молочной кислоты х (ммоль/л) рассчитывают по формуле с1000 х = —————, 0,1∙1000
где с – количество молочной кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику, ммоль; 0,1 – объем крови, взятый на исследование, мл; 1000 в числителе – коэффициент пересчета на 1 л крови; 1000 в знаменателе – коэффициент перевода микромолей в миллимоли. Оформление работы. Рассчитать содержание молочной кислоты в крови обследуемого. В выводе указать на возможные сдвиги концентрации молочной кислоты и их причины. Практическое значение работы. В норме содержание молочной кислоты в крови составляет 0,50-2,0 ммоль/л. Увеличение ее содержания может наблюдаться при усиленной мышечной работе, при заболеваниях, сопровождающихся развитием гипоксии (недостаточность сердечной деятельности, хронические бронхиты, анемия и т.д.). Работа 49. Определение содержания пировиноградной кислоты в крови по Фридеману и Хаугену
Реактивы. Трихлоруксусная кислота, 5%-ный раствор; 2,4-динитрофенилгидразин (2,4-ДНФГ), 0,1%-ный раствор в 2 М растворе соляной кислоты; толуол; карбонат натрия, 10%-ный раствор; гидроксид натрия, 1,5 М раствор. Оборудование. Пенициллиновые флакончики с полиэтиленовыми пробками; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; бюретка вместимостью 25 мл; пипетка с резиновой грушей; центрифуга с центрифужными весами; ФЭК. Материал. Кровь. Принцип метода см. работу 31. Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 1 мл крови, приливают 4 мл раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают встряхиванием и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. В пенициллиновый флакон отбирают 1 мл центрифугата, прибавляют 2 мл воды и 1 мл раствора 2,4-ДНФГ, перемешивают встряхиванием, закрывают пробкой и ставят в темное место на 20 мин. К содержимому флакона добавляют 5 мл толуола, закрывают флакон пробкой и встряхивают 3 мин. После расслоения фаз отсасывают пипеткой с резиновой грушей нижний слой и отбрасывают его. К оставшемуся во флаконе слою толуола приливают 4 мл раствора карбоната натрия, закрывают флакон пробкой и встряхивают 3 мин. После расслоения жидкостей отбирают из нижнего слоя 3 мл в пробирку и добавляют в нее 3 мл раствора гидроксида натрия (появляется красно-бурое окрашивание). Через 5 мин фотометрируют пробу на ФЭКе при 415 нм (светофильтр синий) в кювете с толщиной слоя 1 см против воды. Расчет. Содержание пировиноградной кислоты х (ммоль/л) рассчитывают по формуле
с 1000∙3 х = ——————, 4∙1000
где с – количество пировиноградной кислоты в пробе, найденное по калибровочному графику, мкмоль; 1000 в числителе – коэффициент пересчета на литр крови; 1000 в знаменателе – коэффициент пересчета мкмоль в ммоль; 4 – объем добавленного раствора карбоната натрия, мл; 3 – объем раствора карбоната натрия, отобранного для проведения реакции, мл. Оформление работы. По полученному значению экстинкции рассчитать содержание пировиноградной кислоты в крови и сделать вывод о причине возможных его изменений. Практическое значение работы. В норме содержание пирувата в крови составляет 0,1-0,13 ммоль/л. Его уровень повышается при недостатке в организме тиамина (витамина В1), а также в результате действия ингибиторов пируватоксидантного комплекса (арсенат, люизит и др.).
ОБМЕН ЛИПИДОВ
Для изучения состояния липидного обмена в организме используется определение содержания липидных компонентов в биологических жидкостях. Разные липиды входят в состав сложноорганизованных комплексов – липопротеидов – или адсорбируются белками, в основном альбуминами, плазмы или сыворотки крови. В крови содержатся хиломикроны, образующиеся в слизистой тонкого кишечника и поступающие в нее с лимфой, пре-β-липопротеиды (липопротеиды очень низкой плотности), β-липопротеиды (липопротеиды низкой плотности) и α-липопротеиды (липопротеиды высокой плотности). Апопротеиды трех последних классов липопротеидов синтезируются в печени, поэтому по содержанию липопротеидов в крови судят не только о липидном обмене, но и функции печени. При исследовании обмена липидов в клинике определяют содержание липопротеидов, общих липидов, включающих сумму всех липидных веществ сыворотки или плазмы крови, а также отдельные их фракции – триацилглицерины, неэтерифицированные жирные кислоты, свободный и этерифицированный холестерин, фосфолипиды.
Работа 50. Определение содержания суммарных липидов в сыворотке крови по реакции с сульфофосфованилиновым реактивом
Реактивы. Серная кислота, конц.; фосфованилиновый реактив*. Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки для отмеривания сильных кислот; пипетки вместимостью 0,1; 1 и 10 мл; стеклянные палочки; водяная баня; ФЭК. Материал. Сыворотка крови.
Метод основан на способности продуктов распада ненасыщенных липидов образовывать с фосфованилиновым реактивом соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови. Ход определения. В опытную пробирку (сухую!) вносят 0,1 мл сыворотки крови и 2,9 мл концентрированной серной кислоты (осторожно! Специальными пипетками!), а в контрольную – 0,1 мл дистиллированной воды и 2,9 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивают стеклянной палочкой и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин (осторожно!). Затем обе пробирки быстро охлаждают под струей холодной воды до комнатной температуры. Из опытной и контрольной пробирок отбирают по 0,2 мл охлажденного содержимого в другие пробирки, в которые предварительно наливают фосфованилинового реактива по 3 мл в обе пробирки. После тщательного перемешивания стеклянной палочкой пробы ставят на 45 мин в темное место при комнатной температуре (для развития окрашивания). Фотометрируют опытную пробу против контрольной на ФЭКе при 500-560 нм (зеленый светофильтр), в кювете с толщиной слоя 0,5 см. Расчет. Содержание общих липидов в сыворотке крови х (г/л) рассчитывают по формуле m10000∙3 х = ———————, 0,2∙1000
где m – масса общих липидов в пробе, найденная по калибровочному графику (рис.6), мг; 10000 – коэффициент пересчета на 1 л сыворотки крови; 1000 – коэффициент пересчета миллиграммов в граммы; 3 – общий объем исходной смеси (0,1 мл сыворотки крови + 2,9 мл концентрированной серной кислоты), мл; 0,2 – объем смеси, взятой для проведения цветной реакции, мл. Оформление работы. По найденному значению экстинкции рассчитать содержание общих липидов в крови, указав на возможные изменения в их содержании и причину этих изменений. В выводах отметить практическое использование метода определения общих липидов в клинической лаборатории для выявления нарушений липидного обмена. Практическое значение работы. Нормальное содержание общих липидов в сыворотке крови (нормолипемия) составляет 4,0-8,0 г/л. При физиологических условиях увеличение содержания липидов в крови (гиперлипемия) наблюдается через 1-4 ч после принятия богатой жирами пищи. Натощак уровень общих липидов снижается (гиполипемия). Гиперлипемия проявляется при многих патологических состояниях: у больных сахарным диабетом отмечается резко выраженная гиперлипемия (до 20,0 г/л), при заболеваниях почек (липоидном нефрозе), при поражении печени (циррозе печени и остром гепатите), при ожирении, при врожденной гиперлипемии, атеросклерозе и у лиц, злоупотребляющих алкоголем.
Работа 51. Определение содержания β- и пре- β-липопротеидов
|
||||||||||||||||||
Последнее изменение этой страницы: 2017-01-24; просмотров: 362; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы! infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 54.82.20.97 (0.095 с.) |