Исследования гормонов, медиаторов и их метаболитов

 

В клинико-биохимических лабораториях и фармации используются методы качественного и количественного анализа для определения гормонов, включая и гормоноиды, и медиаторов в биологическом материале и лекарствах. В то же время отклонения в содержании гормонально-медиаторных соединений регистрируют по нарушению регулируемых ими звеньев в обмене веществ.

 

 

Работа 80. Качественные реакции на белково-пептидные гормоны.

 

Реактивы. Биуретовый реактив^*; нингидрин, 0,5%-ный водный раствор; гидроксид натрия, 20%-ный раствор; ацетат свинца, 5%-ный раствор.

Оборудование. Глазные пипетки; штатив с пробирками.

Материал.

1. Инсулин для инъекций.

2. Окситоцин для инъекций.

 

Принцип метода и ход определения см. работу 1, а, б, е.

Берут шесть пробирок и вносят в три из них по 5 капель инсулина, а в три другие – по 5 капель окситоцина. Проделывают с ними биуретовую, нингидриновую реакции и реакцию Фоля, как описано в работе 1, а, б, е.

Оформление работы. Данные занести в таблицу.

 

Препараты гормонов

Реакции

Выявляемая группа

Результат

 

В выводах отметить присутствие соответствующих групп и аминокислот в исследуемых гормональных препаратах.

 

 

Работа 81. Качественные реакции на гормоны –

производные аминокислот

 

Реактивы. Хлорид железа (III), 0,15 М раствор; сульфаниловая кислота, 1%-ный раствор; нитрит натрия, 5%-ный раствор; карбонат натрия, 10%-ный раствор; гексацианоферрат (III) калия K₃[Fe(CN)₆] 0,2%-ный раствор; гидроксид натрия, 5 М раствор; аскорбиновая кислота, кристаллическая; азотная кислота, конц.; иодат калия KIO₃, 1%-ный раствор; хлороформ.

Оборудование. Штатив с пробирками; глазные пипетки; стеклянные палочки; водяная баня; флуороскоп.

Материал.

1. Адреналин, 0,1%-ный раствор в ампулах.

2. Тиреоидин, порошок.

 

а. Реакция на адреналин с хлоридом железа (III). Метод основан на способности пирокатехиновой группировки адреналина образовывать с хлоридом железа (III) комплексное соединение изумрудно-зеленого цвета:

 

Ход определения. В пробирку приливают 10 капель раствора адреналина и добавляют 1 каплю раствора хлорида железа (III). Наблюдают появление характерного окрашивания.

б. Реакция на адреналин с диазобензолсульфокислотой. Метод основан на способности адреналина образовывать с диазобензолсульфокислотой соединение красного цвета.

Ход определения. Для получения диазобензолсульфокислоты в пробирку наливают по 3 капли раствора сульфаниловой кислоты и нитрита натрия, перемешивают встряхиванием. Затем в пробирку добавляют 5 капель раствора адреналина и 3 капли раствора карбоната натрия. Содержимое перемешивают встряхиванием и наблюдают за развитием характерной окраски.

в. Обнаружение адреналина по образованию флуоресцирующего продукта его окисления – адренолютина. Метод основан на способности адреналина окисляться под действием K₃[Fe(CN)₆] в адренохром, из которого в щелочной среде образуется адренолютин, имеющий желто-зеленую флуоресценцию:

 

 

 

 

Ход определения. В две пробирки вносят по 1 капле исходного раствора адреналина и добавляют в одну из них 5, а во вторую 10 мл воды. Перемешивают стеклянной палочкой.

В две другие пробирки отмеривают по 4 мл разведенных растворов адреналина, приливают по 0,3 мл раствора K₃[Fe(CN)₆] и оставляют стоять 5 мин (при этом адреналин окисляется в адренохром).

В каждую пробирку прибавляют на кончике скальпеля кристаллической аскорбиновой кислоты и по 4 мл раствора гидроксида натрия. Содержимое перемешивают стеклянной палочкой (аскорбиновая кислота препятствует дальнейшему окислению адренохрома, а гидроксид натрия способствует превращению его в адренолютин).

Пробирки помещают в штатив флуороскопа и сравнивают интенсивность характерной флуоресценции в пробах.

г. Обнаружение иодтиронинов. Метод основан на отщеплении при кислотном гидролизе тиреоидных гормонов (иодтиронины) иодистоводородной кислоты

 

Иодтиронины HIO₃

(тироксин, HI + Продукты гидролиза

трииодтиронин) нагревание

 

при взаимодействии которой с иодатом калия выделяется свободный иод:

 

5HI + KIO₃ + HNO₃ → 3I₂ + KNO₃ + 3H₂O

 

В хлороформе иод имеет фиолетовую окраску.

Ход определения. В пробирку помещают несколько кристаллов тиреоидина, добавляют 10 капель концентрированной азотной кислоты и нагревают 3-5 мин в кипящей водяной бане. Затем приливают 20 капель раствора иодата калия. Содержимое перемешивают и охлаждают.

В пробирку добавляют 15 капель хлороформа. Встряхивают и отмечают характерную окраску хлороформа.

Оформление работы. Данные занести в таблицу.

 

Исследуемый гормон

Реакция

Результат

 

В выводе отметить возможность практического использования этих реакций.

 

 

Работа 82. Качественные реакции на стероидные гормоны

и их метаболиты

 

Реактивы. Серная кислота, конц.; гидроксид натрия, 30%-ный раствор; реактив Фолина; м-динитробензол, 2%-ный раствор в 96%-ном этаноле.

Оборудование. Глазные пипетки; штатив с пробирками; пипетка для концентрированных кислот; водяная баня.

Материал. Фолликулин (эстрон), 0,1%-ный масляный раствор для инъекций в ампулах. (Для приготовления спиртового раствора содержимое 5 ампул фолликулина выливают в делительную воронку, содержащую 50 мл этанола. Воронку встряхивают и после расслоения фаз нижний, масляный слой отбрасывают, а для исследования используют верхний – спиртовой раствор).

 

а. Реакция на фенольную группу эстрона (фолликулин) с серной кислотой. Метод основан на взаимодействии эстрона и серной кислоты с образованием соединения, имеющего соломенно-желтый цвет, переходящий при нагревании в оранжевый.

Ход определения. В сухую пробирку вносят 5 капель спиртового раствора фолликулина и помещают ее на 5 мин в кипящую водяную баню (для испарения спирта).

Добавляют в пробирку 1 мл концентрированной серной кислоты и ставят ее на 5-10 мин в кипящую водяную баню. Наблюдают за изменением окрашивания содержимого пробирки.

б. Реакция на фенольную группу эстрона (фолликулин) с реактивом Фолина. Принцип метода см. работу 58.

Ход определения. В пробирку вносят 5 капель спиртового раствора фолликулина и добавляют по 2 капли раствора гидроксида натрия и реактива Фолина. Наблюдают за появлением синего окрашивания, обусловленного наличием фенольной группы в молекуле эстрона.

 

в. Реакция на 17-кетогруппу эстрона (фолликулин) и на 17-кетостероиды, содержащиеся в моче. Метод основан на способности 17-кетостероидов образовывать с м-динитробензолом в щелочной среде продукты конденсации вишнево-красного цвета.

Ход определения. В одну пробирку вносят 5 капель спиртового раствора фолликулина, в другую – 5 капель мочи и добавляют в них по 5 капель растворов гидроксида натрия и м-динитробензола. Перемешивают содержимое встряхиванием и наблюдают за развитием характерного окрашивания.

Оформление работы. Данные занести в таблицу. В выводе указать на возможность использования реакции для определения стероидных гормонов.

 

Материал

Выявляемая группа

Реакция

Окрашивание

 

Практическое значение работы. Специфические реакции на гормоны разной структуры используются для их количественного определения и при анализе гормональных препаратов в контрольно-аналитических лабораториях. Определение продуктов обмена стероидных гормонов 17-кетостероидов используется в клинике для оценки функционального состояния коры надпочечников и половых желез. К 17-кетостероидам относятся эстрон и андростерон; часть их образуется из 17-гидроксистероидов (кортизол, кортизон) в коре надпочечников. В норме содержание 17-кетостероидов в суточной моче составляет у мужчин 0,10-0,16 г, у женщин 0,06-0,13 г. В состоянии стресса (напряжения) повышается содержание кортикостероидов в крови и увеличивается выделение их с мочой.

 

 

Работа 83. Регуляция инсулином и адреналином

уровня глюкозы в крови животных

 

Реактивы. Цитрат натрия, 10%-ный раствор; хлорид натрия, 9 г/л раствор; этанол, 70%-ный.

Оборудование. Шприцы; инъекционные иглы; ножницы; вата; микропипетки; весы. Остальные реактивы и оборудование как в работе 46.

Материал.

1. Инсулин во флаконах для инъекций, 40 ЕД/мл.

2. Адреналин, 0,1%-ный раствор для инъекций.

Объект исследования. Кролики.

 

Метод основан на определении в динамике содержания глюкозы в крови после введения инсулина или адреналина. Концентрация глюкозы в крови измеряется о-толуидиновым методом, описанным в работе 48.

Ход определения. Для взятия крови берут двух кроликов, голодавших 12 ч. Их взвешивают, выстригают шерсть на ухе, находят краевую вену, зажимают ее пальцем у основания уха. После того, как вена наполнится кровью, ее прокалывают инъекционной иглой и вытекающие капли крови собирают на часовом стекле, смоченном раствором цитрата натрия (чтобы кровь не свернулась). Набирают примерно 0,5 мл крови, ранку на ухе кролика зажимают ватным тампоном, смоченным этанолом, в течение полминуты.

Одному кролику вводят раствор инсулина, разведенный хлоридом натрия из расчета 1,5 ЕД на 1 кг массы тела, а другому – раствор адреналина из расчета 0,35 мл на 1 кг массы тела. Через 30 и 60 мин у обоих кроликов забирают кровь, как описано выше.

Микропипеткой отбирают по 0,1 мл крови, взятой перед опытом и через 30 и 60 мин после введения инсулина и адреналина. Определяют содержание глюкозы в крови по методике, описанной в работе 46.

 

Примечание. После введения инсулина постоянно наблюдают за кроликом, так как большая доза инсулина может вызвать резкое снижение содержания сахара в крови и привести к смерти. Если у кролика начнутся признаки судорог, следует немедленно ввести 1 мл адреналина. По окончании опыта кролику вводят 20 мл 20%-ного стерильного раствора глюкозы под кожу.

 

Оформление работы. Полученные результаты занести в таблицу и построить график зависимости содержания глюкозы в крови от вводимых гормонов и времени их действия.

 

Гормон

Доза гормона

Время взятия крови после введения гормона

Содержание глюкозы в крови

 

В выводах отметить разницу в действии инсулина и адреналина на уровень глюкозы в крови животных и практическое значение работы.

Практическое значение работы. Инсулин и адреналин регулируют содержание глюкозы в крови, что позволяет по изменению ее концентрации судить об эффекте данных гормональных препаратов. В фармации это используют для стандартизации заводских препаратов инсулина и контроля его качества. Гипогликемическое действие инсулина используют для лечения больных сахарным диабетом, а адреналин применяют при гипогликемических состояниях, в частности, вызванных передозировкой инсулина.