Определение коли-титра и коли-индекса воды методом мембранных фильтров.

Кишечная палочка —постоянный обитатель толстого отдела кишечника человека и всех тепло­кровных животных. индикатор фекального загрязнения внешней среды и косвенный показа­тель наличия в воде болезнетворных микробов
Коли-индекс (индекс кишечной палочки) — это число ки­шечных палочек, обнаруженных в 1 л исследуемой воды.
Коли-титр определяют методами бродильных проб. основан на способности кишечной палочки развиваться при повышенных температурах и сбраживать сахара (маннит, глюко­зу и др.) с выделением газа.
1. ставят первую бродильную пробу: различные разведения исследуемой воды при помощи стериль­ных пипеток вносят в колбы и пробирки со специальными уг­леводными жидкими средами (Эйкмана)
Соотношение между средой и засеваемой водой должно быть 1:2. Посевы выращивают в термостате при 43-44°С в тече­ние 24 ч. При указанной температуре подавляется развитие микроорганизмов, не имеющих санитарно-показательного зна­чения для воды. Затем просматривают посевы (наличие пузырьков газа в поплавках, изменение цвета, помутнение).
2. при помощи бактериальной петли дела­ют высев в чашки Петри со средой Эндо и выращивают куль­туру при 37 °С 24 ч. образуют типичные темно-красные, ярко-красные или розовые колонии с темным центром, имеющие металлический блеск или без негоПри отсутствии характерного роста на пробу дают отрицательный ответ.
При наличии типичных колоний из них делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Если в мазках обнаруживают мелкие неспорообразующие грамотрицательные палочки, то переходят к 3 эт.

3. делают пересев в разведенную жидкую углеводную сре­ду (Эйкмана и др.). Посевы выращивают при 43— 44°С в течение 24 ч, после чего учитывают окончательно. При наличии в посевах помутнения, газообразования и изменения цвета дают положительный ответ, результаты которого выра­жают в виде коли-титра.
Коли-индекс определяют методом мембранных фильтров— пористые пленки из микроклет­чатки. подвергают стерилизации двойным кипячени­ем в дистиллированной воде в течение 15—20 мин. Затем сте­рильным пинцетом фильтры помещают на прибора Зейтца. проводят фильтрацию под ваку­умом определенного кол-ва исследуемой воды (через один мембранный фильтр — не более 100 мл воды).
фильтр кладут осадком вверх на поверхность среды Эндо, залитой в чашку Петри, плотно прижимая к сре­де. В одну чашку можно поместить 4—5 фильтров. После куль­тивирования в термостате при 37⁰С в течение 18—24 ч подсчи­тывают выросшие на фильтре колонии, характерные для груп­пы кишечной палочки. берут материал для мазков, окрашивают их по Граму и микроскопируют.
Если в мазках присутствуют мелкие грамотрицательные неспорообразующие палочки, из оставшейся части колонии де­лают пересев в пробирки с небольшим объемом жидкой угле­водной среды. Посевы выращивают при 43—44°С в течение 24 ч. Наличие газообразования + р-я

Определение чувствительности микроорганизма к антибиотикам методом Стандартных дисков.

Культуру засевают газоном на питательный агар или среду АГВ в чашке Петри.

Среда АГВ: сухой питательный рыбный бульон, агар-агар, натрий фосфат двузамещенный.

На засеянную поверхность пинцетом помещают на одинаковом расстоянии друг от друга бумажные диски, содержащие определенные дозы разных антибиотиков. Посевы инкубируют при 37 °С до следующего дня. По диаметру зон задержки роста исследуемой культуры бактерий судят о ее чув­ствительности к антибиотикам.

Определение чувствительности микроорганизма к антибиотикам методом серийных разведений

Осн р-р АБ готовят с пом буф р-ра или спец р-ля. Серийные разведения препарата готовят в пробирках, содерж 1 мл мясо-пепт бульона. В 1-ю проб вносят 1 мл исходн р-ля,после чего готовят серию разведений препарата. В кажд вносят 0,1 мл бакт сусп. Готовят контроли (мпб+сусп, мпб_АБ). Инкубир. Отсутствие помутнения – задержка роста в присутств данной конц аб

Реакция гемолиза: техника постановки, механизм реакции, учёт результатов.

Является разновидностью реакции лизиса. В качестве АГ в этой реакции применяют эритроциты, которые лизируются гемолизинами в присутствии комплемента. Для постановки реакции гемолиза необходимы: 1) эритроциты барана; 2) гемолитическая сыворотка, содержащая гемолизины к бараньим эритроцитам и 3)комплемент.

Протекает в две фазы. В первой фазе происходит взаимодействие между эритроцитами и гемолитической сывороткой, во второй- сенсибилизированные эритроциты фиксируют комплемент и наступает лизис.

Для постановки реакции гемолиза в 1 пробирку вносят по 0,5мл гемолитической сыворотки, комплемента, разведенного 1:10, 3% взвеси бараньих эритроцитов по осадку. 2 пробирка служит контролем комплемента, 3 пробирка –гемолитической сывороткой, 4 пробирка –эритроцитов. Учет после инкубации смеси в течении 1часа.

25. Биологические методы исследований направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение возбудителя (особенно при незначительном исходном содержании в исследуемом образце). Методы включают заражение лабораторных животных исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы. Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных — важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведения биологических проб используют только здоровых животных определённых массы тела и возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно и подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У животных прижизненно забирают кровь, экссудат из брюшины, после гибели — кровь, кусочки различных органов, СМЖ, экссудат из различных полостей.

26. Ориентировочная реакция агглютинации (техника постановки, учёт результатов).

ОРА выполняют перед постановкой развернутой реакции для того, чтобы получить предварительное представление о выделенном виде или сероваре бактерий

Ставят при комнатной температуре на предметных стеклах. Для этого пастеровской пипеткой наносят на стекла раздельно друг от друга капли сыворотки в небольших разведениях(1:10-1:20) и две капли 0,5% раствора натрия хлорида(Контроль). В каждую каплю(за исключением контрольной) вносят подозрительные колонии, снятые с поверхности плотной питательной среды.Перемешивают до помутнения. Результаты реакции учитывают через 5-10 минут. При положительной реакции в капле с сывороткой появляются крупные ли мелкие хлопья, при отрицательной- жидкость остается равномерной мутной.

27. Развёрнутая реакция агглютинации(техника постановки, учёт результатов).

Для определения AT в сыворотке крови больного ставят развёрнутую реакцию агглютинации (РА). Для этого к серии разведений сыворотки крови добавляют диагностикум — взвесь убитых микроорганизмов или частицы с сорбированными Аг. Максимальное разведение, дающее агглютинацию Аг, называют титром сыворотки крови.

Агглютинацией называют склеивание бактерий при действии на них специфических АТ в присутствии электролита. Ее используют: 1) для определения вида и серовара выделенных бактерий, 2) для обнаружения АТ в сыворотке крови больного (серодиагностика).

Для постановки РА необходимы три компонента: АГ(агглютиноген), АТ(агллютинин) и электролит(изотонический раствор натрий хлорида). В качестве АГ в РА применяют 18-24ч взвеси живых или убитых формалином, спиртом бактерий. Наиболее стабильным АГ являются взвеси убитых микроорганизмов.

На предметное стекло наносят каплями:

1-ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям дизентерии;

2-ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа;

Ья капля: - физиологический раствор (контроль).

Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий. Перемешивают.