Количественное определение гемоглобина в крови

Гемоглобинцианидным методом

Задание 1.Определить содержание гемоглобина в крови гемоглобинцианидным методом.

Принцип. Гемоглобин крови при взаимодействии с железосинеродистим калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин.

Ход работы. К 5 мл трансформирующего раствора прибавляют 0,02 мл крови (разведение в 25 раз), хорошо перемешивают. Определение проводят через 10 мин против холостой пробы (трансформирующего раствора). Определяют оптическую плотность на спектрофотометре при 540 нм в 1 см кювете. Содержание гемоглобина (Х) в г/л рассчитывают по формуле:

Х= D₅₄₀ × 367,7. При фотометрировании определение проводят в диапазоне волн 500-560 нм (зеленый светофильтр). Эталонный раствор гемоглобина готовят так же, как и пробу цельной крови. Расчет содержания гемоглобина (В) в г/л проводят по формуле: В=(D_оп.×120)/D_эт., где D_оп. – оптическая плотность опытной пробы; D_эт. - оптическая плотность эталонной пробы; 120 - содержание гемоглобина в эталонном растворе (г/л).

Клинико-диагностическое значение. В норме содержание гемоглобина в крови для мужчин составляет 130-160 г/л, для женщин – 120-140 г/л. Определение содержания гемоглобина – необходимый этап диагностики разных заболеваний. Повышение гемоглобина в крови может быть связано со следующими состояниями: 1) заболевания, при которых повышается уровень эритроцитов; 2) повышение кислородной ёмкости крови, вызванное гипоксией при сердечно-сосудистой патологии; проживании в высокогорных районах; ожирении, курении и образовании неактивного гемоглобина; 3) обезвоживание организма; 4) стресс и высокие физические нагрузки; 5) новообразования в почках, печени, ЦНС, яичниках; нарушение функции сосудов; 6) нарушение гормонального уровня (повышение кортикостероидов или андрогенов); 7) химические отравления угарным газом, нитратами или лекарствами; 8) ожоги. Снижение гемоглобина в крови может быть следствием: 1) кровотечений; 2) снижения уровня эритроцитов при разных видах анемий (дефицит витаминов В₁₂ и В₉; дефицит витамина С; нехватка железа; интоксикации или нарушение работы почек; нарушение созревания эритроцитов). Снижение гемоглобина могут вызывать разнообразные факторы: неполноценное питание; нарушение работы желудочно-кишечного тракта; употребление большого количества чая, кофе и других продуктов, тормозящих всасывание железа.

ЛИТЕРАТУРА

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 263-269, 419-423.

2. Губський Ю.І. Біологічна хімія. Підручник. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 317-323, 502-507.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини: Підручник. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 553-562.

4. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 78-85, 503-506.

5. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 636-645.

6. Практикум з біологічної хімії / Бойків Д.П., Іванків О.Л., Коби-лянська Л.І. та ін./ За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 255-262.

ЗАНЯТИЕ 6

Тема: Обмен гемоглобина; его распад. Биохимия жёлчных пигментов. Желтухи. Количественное определение билирубина и его фракций в сыворотке крови.

Актуальность. Продолжительность жизни эритроцитов составляет около 120 суток, на протяжении которых они снашиваются и разрушаются; гемоглобин высвобождается и подлежит расщеплению на глобин и гем в селезёнке, костном мозге и купферовских клетках печени. Белковая часть подвергается обычным преобразованиям, присущим простым белкам. Молекула гема подвергается многоступенчатым преобразованиям, конечным продуктом которых является стеркобилин, который выводится с калом и мочой. При распаде гемоглобина образуются жёлчные пигменты (биливердин, билирубин и др). Билирубин вследствие слабой растворимости и токсичности транспортируется альбуминами крови и поступает на синусоидальную поверхность гепатоцитов путём облегчённого транспорта. В печени происходит конъюгация билирубина с глюкуроновой кислотой (УДФГК) под действием фермента УДФ-глюкуронилтрансферазы и преобразование в моно- и дибилирубинглюкурониды. Конъюгированный билирубин путём активного транспорта поступает в жёлчь и дальше в желудочно-кишечный тракт, где происходят его дальнейшие преобразования. Таким образом, существуют две формы билирубина: 1) неконъюгированный, свободный (билирубин-альбумин) и 2) конъюгированный, связанный (билирубинглюкурониды). По предложению Ван ден Берга первый приобрёл название «непрямого» (дает диазореакцию Эрлиха после предварительной обработки метанолом, кофеиновым реактивом), а второй - «прямого» (дает диазореакцию без предварительной обработки). Знание путей распада гемоглобина является важным для будущих врачей в связи с диагностированием разных заболеваний, дифференциальной диагностикой желтух, которые могут быть связаны с заболеваниями печени и ферментопатиями, а также с возможной коррекцией этих нарушений.

Цель. Ознакомиться с ферментативным процессом распада гемоглобина в организме; жёлчными пигментами, которые образуются при этом, их преобразованием и значением исследования в крови, моче и кале. Особое внимание обратить на фракции билирубина и клинико-диагностическое значение их определения в сыворотке крови. Выучить нарушение обмена жёлчных пигментов и факторы, которые их вызывают. Уметь связывать знание теоретического материала с конкретными результатами лабораторных исследований и использовать их как критерии для установления вида той или иной желтухи. Ознакомиться с методом количественного определения общего билирубина и фракций в сыворотке крови и его клинико-диагностическим значением.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

1. Общая схема распада гемоглобина.

2. Жёлчные пигменты, их преобразование, значение исследования в крови, моче и кале.

3. Прямой и непрямой билирубин крови. Значение исследования.

4. Патобиохимия желтух: гемолитическая, паренхиматозная, обтурационная.

5. Ферментативные, наследственные желтухи: синдром Криглера-Найяра (“конъюгированная желтуха”), болезнь Жильбера (“абсорбционная желтуха”), синдром Дабина-Джонсона (“экскреционная желтуха”).

6. Ферментативные желтухи новорожденных, способы их предотвращения и лечения.

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Назовите реакции катаболизма гемоглобина, которые протекают в клетках ретикулоэндотелиальной системы.

А. Глюкуронилтрансферазная. В. Восстановление биливердина. С. Образование стеркобилиногена. D. Гемоксигеназная.

Е. Расщепление мезобилиногена до дипиррольных соединений. F. Восстановление билирубина.

2. Назовите реакции катаболизма гемоглобина, которые протекают в гепатоцитах.

А. Глюкуронилтрансферазная. В. Восстановление биливердина. С. Образование стеркобилиногена. D. Гемоксигеназная.

Е. Расщепление мезобилиногена до дипиррольных соединений. F. Восстановление билирубина.

3. Назовите реакцию катаболизма гемоглобина, которая протекает в кишечнике.

А. Глюкуронилтрансферазная. В. Восстановление биливердина. С. Образование стеркобилиногена.

D. Гемоксигеназная. Е. Расщепление мезобилиногена до дипиррольных соединений.

4. Какой из перечисленных жёлчных пигментов не выделяется с мочой?

А. Конъюгированный билирубин. В. Неконъюгированный билирубин.

С. Уробилиноген. D. Стеркобилиноген.

5. У мужчины, 38 лет, с желтушной кожей отмечается анемия, увеличение селезёнки, гипербилирубинемия (билирубин непрямой), уробилинурия, гиперхоличный кал. Для какого состояния характерны эти изменения?

А. Надпечёночной желтухи. В. Подпечёночной желтухи. С. Клеточно-печёночной желтухи.

D. Болезни Жильбера. Е. Синдрома печёночной недостаточности.

6. У новорожденного содержание билирубина повышено (за счет непрямого), кал интенсивно окрашен (повышено содержание стеркобилина), в моче билирубин не выявлен. О какой желтухе идёт речь?

А. Печёночно-клеточной. В. Гемолитической.

С. Обтурационной. D. Наследственной.

Е. Желтухе новорож- денных.

7. У больного желтушность кожи, склер, слизистых оболочек. Моча цвета темного пива, кал гипохоличный. В крови повышено содержание билирубина как прямой, так и непрямой фракции, повышена активность АлАТ, ЛДГ₄ и ЛДГ₅. В моче определяется билирубин. О каком виде желтухи идёт речь?

А. Наследственной. В. Гемолитической.

С. Обтурационной. D. Паренхиматозной.

Е. Желтухе новорожден- ных.

8. У больного ребенка, 10 лет, выявлены тяжёлые неврологические нарушения, желтушность кожи, в сыворотке крови повышен уровень неконъюгированного билирубина. Вследствие нарушения синтеза какого фермента возникает болезнь Жильбера?

А. УДФ-дегидрогеназы. В. УДФ-глюкуронилтрансферазы.

D. Глицеролкиназы. С. Галактозо-1-фосфатуридилил- трансферазы.

9. Пациент обратился в клинику с жалобами на общую слабость, боли в животе, плохой аппетит, наблюдаются признаки желтухи. В сыворотке крови содержание общего билирубина составляет 77,3 мкмоль/л, а конъюгированного - 70,76 мкмоль/л. Какой наиболее вероятный диагноз?

А. Острый гепатит. В. Цирроз печени.

С. Механическая желтуха. D. Обтурационная желтуха.

Е. Гемолитическая желтуха.

10. Укажите продукт распада гемоглобина в печени:

А. Биливердин. В. Билирубин.

С. Вердоглобин. D. Порфобилиноген.

Е. Стеркобилин.

11. Укажите белок плазмы крови, который соединяется с гемоглобином при гемолизе эритроцитов:

А. Трансферрин. В. Гаптоглобин.

С. Ингибитор трипсина. D. Интерферон.

Е. Альбумин.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА