Определение уксусной кислоты методом газожидкостной

ХРОМАТОГРАФИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХРОМАТОГРАФА

«КРИСТАЛ ЛЮКС 4000М».

По числу отравлений уксусная кислота занимает одно из первых мест наряду с этиловым спиртом и его суррогатами, окисью углерода, лекарственными препаратами, что связано главным образом с широким применением её в быту в виде уксусной эссенции и уксуса. Зачастую она используется с суицидной целью.

Уксусная кислота при отравлении местно действует слабее, чем неорганические кислоты (ожоги кожи вызываются растворами уксусной кислоты с концентрацией 30% и выше), но резко проявляется её резорбтивное действие (некрозы, геморрагии в печени, гемолиз).

При вскрытии трупов при отравлении уксусной кислотой от полостей тела обычно ощущается характерный запах. Так же наблюдаются ожоги и кровоизлияния в ротовой полости, пищеводе и желудке. Смертельной дозой считается 15 граммов.

Исследование уксусной кислоты методом перегонки с водяным паром достаточно трудоёмко и позволяет получить в дистилляте около 50% содержащейся в водных растворах кислоты и не более 0,3-0,4% уксусной кислоты, содержащейся в не загнившем биологическом материале. [1]

Объектами исследования являются желудок с содержимым, глотка, пищевод, печень, почка. [2]

Предлагается методика химико-токсикологического анализа уксусной кислоты методом газо-жидкостной хроматографии (ГЖХ).

Прямой ГЖХ анализ уксусной кислоты затруднителен из-за наличия в ней кислотного центра. Поэтому было применено исследование уксусной кислоты после этерификации. Сущность метода заключается в пробоподготовке трупного материала с использованием реакции этерификации уксусной кислоты этанолом в сернокислой среде (образование сложного эфира) непосредственно в биообъекте. Последующее исследование полученного этилацетата производится ГЖХ анализом равновесной парогазовой фазы с использованием капиллярной колонки и детектора ионизации пламени (ДИП). Образующиеся в результате этерификации продукты обладают высокой летучестью, что делает их пригодными для исследования данным методом. Для количественного определения используется метод внутреннего стандарта.

Преимущества методики.

1) Значительно сокращается время анализа за счет исключения стадии перегонки;

2) За счёт ввода в хроматограф пробы в виде парогазовой фазы исключается засорение колонки нелетучими компонентами (как в случае ввода жидкой пробы), к чему особенно чувствительна капиллярная колонка.

 

Условия газохроматографического исследования.

Газовый хроматограф «КристалЛюкс 4000М», детектор ПИД, колонка капиллярная кварцевая фирмы «Zebron» (США) длиной 30 м, диаметром 0,32 мм, неподвижная жидкая фаза ZB -1,толщина слоя 0,5 мкм. Температура колонки - 60°С, детектора - 150°С, испарителя -120°С. Расходы газов: газа–носителя гелия 25 мл/мин; сброс -30 мл/мин; поддув -15 мл/мин; воздуха -250 мл/мин; водорода – 30 мл/мин. Время анализа -5 мин. Возможно использование других хроматографов с аналогичными характеристиками, а так же колонок других производителей, обеспечивающих достаточное разделение исследуемых компонентов.

 

Методика исследования.

 

Для того, чтобы убедиться в отсутствии в исследуемом объекте этилацетата, следует провести предварительный ГЖХ анализ парогазовой фазы по следующей методике.

2,0 грамма измельчённого объекта помещают в пенициллиновый флакон, закрывают резиновой пробкой, которую герметично фиксируют к горловине. Флакон помещают на водяную баню при 60°С на 10 мин. Отбирают предварительно нагретым и проверенным на отсутствие фонового газовыделения шприцем 0,2 мл парогазовой фазы и вводят в испаритель хроматографа. Исследование проводят в течении 5 мин при описанных выше условиях. При наличии в объекте этилацетата наблюдают появление пика со временем удерживания tR= 2,98 мин. В этом случае описываемая методика не может быть использована. Этанол, при его наличии в объекте, не влияет на результат качественного и количественного определения.

А.Качественное определение.

 

2,0 грамма измельченного объекта помещают в пенициллиновый флакон, добавляют 2,4 мл этанола, 0,1 мл концентрированной серной кислоты, оставляют на 1 час при встряхивании. Добавляют 1,4 мл концентрированной серной кислоты, флакон закрывают резиновой пробкой, которую герметично фиксируют к горловине, встряхивают 3 мин. Флакон помещают на водяную баню при 60°С на 10 мин. Отбирают предварительно нагретым и проверенным на отсутствие фонового газовыделения шприцем 0,2 мл парогазовой фазы и вводят в испаритель хроматографа. Исследование проводят в течении 5 мин при описанных выше условиях. При наличии уксусной кислоты наблюдают появление пиков этанола с временем удерживания tR= 2,29 мин и этилацетата с tR= 2,98 мин. При её отсутствии наблюдают только пик этанола с tR= 2,29 мин.

 

Б.Количественное определение.

 

2,0 измельченного объекта помещают в пенициллиновый флакон, добавляют 2,4 мл этанола, 0,1 мл концентрированной серной кислоты, 1,0 мл 20% раствора н-пропанола, оставляют на 1 час при встряхивании. Добавляют 1,4 мл концентрированной серной кислоты, флакон закрывают резиновой пробкой, которую герметично фиксируют к горловине, встряхивают 3 мин. Флакон помещают на водяную баню при 60°С на 10 мин. Отбирают предварительно нагретым и проверенным на отсутствие фонового газовыделения шприцем 0,2 мл парогазовой фазы и вводят в испаритель хроматографа. Исследуют в течении 5 мин при описанных выше условиях. При наличии уксусной кислоты наблюдают появление пиков этанола со временем удерживания tR= 2,29 мин, н-пропанола с tR= 2,63 мин, этилацетата с tR= 2,98 мин. При отсутствии уксусной кислоты наблюдают появление пиков этанола со временем удерживания tR= 2,29 мин и н-пропанола с tR= 2,63 мин.

Образцы хроматограмм, полученных при проведении анализа, приведены на рисунках № 1-4.

На различных хроматографах величины tR могут незначительно отличаться ввиду различий в свойствах колонок.

Расчёт концентрации производится по калибровочному графику или с помощью программы «Net Chrom V 2.1.». При построении калибровочного графика по оси абцис откладывается отношение площадей уксусной кислоты и внутреннего стандарта, а по оси ординат – концентрация уксусной кислоты. При использовании программы «Net Chrom V 2.1.» метод с количественным расчётом создаётся так же, как при анализе алкоголя. Использование для расчёта площадей, а не высот пиков позволяет получать более точные результаты. Для приготовления стандартов при калибровочной используются водные растворы уксусной кислоты с концентрациями 0,05%, 0,1%, 0,25%, 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,5 %, 5,0%.

Методика подготовки калибровочной пробы аналогична подготовке пробы для количественного определения, где вместо биообъекта берётся 2,0 мл стандартного раствора уксусной кислоты.