Определение удельного показателя поглощения.

В три мерные калибровочные пробирки (для трех повторных определений) на 5 мл вносят по 0,1 мл (100мкг) стандартного спиртового раствора препарата (1мг/мл), добавляют по 3 мл 2н раствора соляной кислоты и гидролизуют в течение 30 минут на глицериновой бане при 125-135°С с обратным холодильником. По окончании гидролиза холодильник промывают 1 мл 2н раствора соляной кислоты и после охлождения гидролизата доводят последний до 5 мл.

Из каждого гидролизата в мерные пробирки вносят по 0,1; 0,25; 0,5% 0,75; 1 мл (2,5, 10, 15, 10 мкг вещества), доводят 2 н раствором соляной кислоты до 3 мл и проводят реакцию образования азокрасителя как указано выше. После определения плотности окрашенного раствора при 550 нм удельный показатель поглощения вычисляют по формуле;

Е^1%_1см = А/ С•L; где

 

А-оптическая плотность раствора;

С-концентрация раствора в весовых процентах;

L-толщина поглощающего слоя в см.

 

В качестве раствора сравнения используют смесь реактивов. Подчинение закону Бугера наблюдается в пределах концентраций 5+ 20 мкг в исследуемой пробе (определение содержание по бензофенону, основанное на получении азокрасителя с бета-нафтолом, проводить нельзя ввиду отсутствия характерного спектра поглощения).

Исследование по нативному соединению с метаболитами.

Методика анализа.

Изолирование. 25 г мелкоизмельченных органов (средняя проба из 100г) заливают в стакане емкостью 200мл 0,5 н раствором соляной кислоты (рН 1) и оставляют при комнатной температуре в течение час, периодически перемешивая и проверяя значение рН среды. Настаивание повторяют 2 раза при тех же условиях. Извлечения объединяют, процеживают через тонкий тампон в делительную воронку на 250 мл и устанавливают рН 3 по универсальному индикатору. Экстрагируют хлороформом трижды по 15 мл. В случае образования эмульсии разделение фаз достигалось центрифугированием извлечения в течение 10 минут при 5000 об/мин. Органическую фазу переносят в мерную колбу на 50 мл, пропуская через воронку с безводным сульфатом натрия, доводят хлороформом до метки и перемешивают. Извлечение исследуют на содержание вещества и его метаболитов.

Хроматографическое исследование. На стартовую линию хроматографической пластинки наносят остаток 1/5 части извлечения, растворенный в минимальном количестве хлороформа. На расстоянии 2 см от первой точки наносят в виде полос 1 см этанольные растворы (1мг/мл) препарата и его метаболитов. Хроматографируют в системе насыщенной парами этилацетат - абсолютный этиловый спирт 9:1. Пробег растворителей 10 см. По удалении растворителей пластинку обрабатывают концентрированной соляной кислотой до полного увлажнения слоя силикагеля. Накрывают покровным стеклом, избегая, прилипания влажного слоя силикагеля и термостатируют при 135-140 °С. По истечении 20 минут покровной стекло снимают, а хроматограмму оставляют в термостате еще на 5 минут. После охлаждения пластинки слой сорбента обрабатывают последовательно реагентами для образования азокрасителя.

Одновременно с первой пластинкой в эту же хроматографическую камеру помещают вторую, на стартовую линию которой наносят полосой 1,5 см остатки из 2/5 и 1/5 части экстрактов. В третью полосу, длиной 1 см, наносят метчик, смесь стандартных растворов (1мг/мл). После поднятия растворителя на 10 см и удаления его со слоя сорбента в токе воздуха, для дополнительной очистки эту пластинку хроматографируют в метаноле с предварительным насыщением камеры в течение 15 минут. После поднятия растворителя на 10 см и удаления его со слоя сорбента в токе воздуха зону, соответствующею 2/5 экстракта, прикрывают стеклом. Остальную часть хроматографической пластинки обрабатывают последовательно реактивом Драгендорфа (модифицированным) и 10 % раствором серной кислоты.. При наличии препаратов 1,4бенздиазепина наблюдаются оранжево-красного цвета пятна. Слой сорбента из зоны соответствующею 2/5 экстракта, параллельно пятнам снимают, и элюируют ацетоном дважды по 5 мл в мерную пробирку.

Фотометрия в УФ-области.

В полученных элюентах удаляют органический растворитель, сухие остатки растворяют в 5 мл этанола и снимают спектры поглощения в УФ-области в диапазоне волн от 200-400нм, раствор сравнения 96° этанол. Измерение в тех же условиях повторяют после добавления в кювету, включая и раствор сравнения, по 3 капли насыщенного раствора гидроокиси натрия. После снятия спектра в щелочной среде в те же кюветы добавляют по 5 капель концентрированной серной кислоты и получают спектр в кислой среде. Характер полос поглощения для хлордиазепоксида и его метаболитов представлен в таблице 2.

 

Таблица 3. Значения Rf и спектральные характеристики хлордиазепоксида и его метаболитов.

 

Вещества	Значения Rf (система этил-ацетат-абс. спирт 9:1)	УФ – спектры (λ в нм)
спирт	кислота	щёлочь
Хлордиазепоксид	0,32
Демоксепам	0,62
Десметилхлордиазепоксид	0,20
Дезоксидемоксепам	0,75

 

При исследовании бензофенонам определяется 60,5 ± 4,3% - 70,0 ± 1,2% от введённого количества. Такой интервал определяемых концентраций зависит от характера анализируемого объекта: степень извлечения значительно снижается при наличии эндогенных соединений липоидной структуры.

При исследовании по неизменному соединению и метаболитам степень извлечения находится в интервале от 55 ± 2,2% до 62 ± 2,8%.

 

Следует упомянуть, что метаболиты оксазепама (в основном глюкурониды) не экстрагируются хлороформом из водного извлечения, переходит в органическую фазу только нативное соединение. Отсюда следует, что при наличии оксазепама. В отличие от хлордиазепоксида, на хроматограмме появляется лишь окрашенное пятно, Rf которого 0,7 – 0,72. В данном случае это немаловажный факт, т.к.селективность анализа при исследовании хлордиазепоксида по бензофенону отсутствует в отношении оксазепама.

Обнаружение например, хлордиазепоксида в объектах, подвергшихся различной степени гнилостного разложения, при исследовании по продукту гидролиза (АХБ) не вызывает затруднений. 70 - 85% хлордиазепоксида удаётся обнаружить при хранении объектов в течение года.

Отрицательное влияние продуктов гнилостного разложения объектов при исследовании неизменённого хлордиазепроксида и его метаболитов (2 этап) проявляется через 3 недели с момента наступления смерти. При более поздних сроках хранения сводится к анализу продукта гидролиза – 2 – амино 5 – хлорбензофенона (1 этап).

 

Таблица 4. Значения Rf лекарственных препаратов, имеющих ароматическую аминогруппу, в системе растворителей этилацетат-абсолютный спирт (9:1)

 

Соединение	В вытяжке из кислого раствора	В вытяжке из щелочного раствора
Оксазепам Диазепам Нитразепам	0,70 0,78 0,76	0,70 0,78 0,76
Анестезин	-	0,93
Стрептоцид Сульгин Сульфадиметоксин Сульфадимезин Этазол	0,70 0,30; 0,85 0,82 - 0,65	0,70 0,30 0,82 0,20; 0,70 -
Парааминобензойная кислота Парааминосалициловая кислота	0,82   0,85

 

ПОЛУЧЕНИЕ МЕТАБОЛИТОВ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ СТАНДАРТНЫХ РАСТВОРОВ (на примере хлордиазепоксида)

 

Для приготовления стандартного раствора использовали, хлордиазепоксид (7 – хлор – 2 диметиламино – 5 фенил – 3н – 1,4 – бензодиазепин – 4 - оксид). 0,050 г препарата растворяют в 96⁰ спирте, объём раствора доводят в мерной колбе до 50 мл (1 мг/мл).

Демоксепам (7 – хлор – 2 – диметиламино – 5 – фенил -3н – 1,4 – бензодиазепин – 2ОН - 4 - оксид ) был получен из 7 – хлор – 2 – (метилацетамид) – 5 – фенил – 3н - 1,4 – бензодиазепин – 4 – оксида: к 0,25 мл раствора последнего добавляют при комнатной температуре 250 мл 1Н раствора соляной кислоты. Через 14 часов смесь подщелачивают и экстрагируют равным? эфира дважды (для очистки). Продукт реакции? и экстрагируют метиленхлоридом. Органический растворитель удаляют, полученный остаток перекристаллизовывают из петролейного эфира. Выход 89%. Чистое вещество в виде пластинок с t плав.=235-236⁰С. Препарат растворяется в щелочах с образованием кристаллических солей. Чистоту определяют хроматографически в системе этилацетат – абсолютный спирт (9:1). Полученное соединение используют для приготовления стандартного раствора: 0,050г демоксепама растворяют в 96⁰ спирте и объём раствора доводят до 50 мл (1 мг/мл).

Дезоксидемоксепам (7 – хлор – 5 – фенил -3н – 1,4 – бензодиазепина – 2ОН) получают из демоксепама: 14,3 г последнего растворяют в 300 мл диоксана. Гидрируют в присутствии 20 г никеля Ренея под давлением при нормальной температуре до поглощения? водорода. Полученную соль фильтруют и концентрируют, упаривая под вакуумом до минимального объёма. Остаток растворяют в диэтиловом эфире или петролейном эфире. После перекристаллизации из ацетона образуются бесцветные пластинки с t плав.= 216 – 217. Выход 92%. Чистоту полученного препарата определяют хроматографически в системе этил-ацетат – абсолютный спирт (9:1). Для приготовления стандартного раствора растворяют 0,050г полученного соединения в 96⁰ спирте и объём раствора доводят в мерной колбе до 50 мл (1 мг/мл).

2 – амино – 5 – хлор – бензофенон (АХБ): К измельчённым таблеткам хлордиазепроксида в круглодонных колбах для гидролиза добавляют 10 мл 6н. раствора соляной кислоты и гидролизуют на глицериновой бане при температуре 120-130⁰С в течение 30 минут. По охлаждении, гидролизат нейтрализуют гранулированным едким натром и устанавливают рН 10. Экстрагируют равным объёмом хлороформа дважды. Органический растворитель удаляют на роторном испарителе. Остаток подвергают очистке в тонком слое силикагеля (подвижная фаза - бензол). Участок сорбента, содержащий 2 – амино – 5 – хлорбензофенон (окрашенный в жёлтый цвет), элюируют ацетоном по 5 мл 4 раза. Органический растворитель удаляют и остаток высушивают до постоянного веса при t = 70⁰. Кристаллический порошок жёлтого цвета с с t плав.= 96,5⁰С. 0,050г 2 амино – 5 – хлор – бензофенона, помещённого в мерную колбу на 50 мл, растворяют в 96⁰ спирте и объём доводят до метки (1мг/мл).