Выделение производных 1,4 –бенздиазепина из биологического материала.

25 г измельченного биологического материала (средняя проба) из 100 грамм каждого органа, помещают в круглодонные колбы с притертой пробкой ёмкостью 250 мл вносят по 50 мл 6н раствора соляной кислоты и гидролизуют на глицериновой бане с обратным холодильником при 125-135 °С в течение часа. По окончании гидролиза холодильник промывают 5 мл 2 н раствора соляной кислоты и промывные воды присоединяют к гидролизату. Горячий гидролизат фильтруют через ватмановский фильтр (белая лента). Остаток на фильтре трижды промывают 2 н раствором соляной кислоты и добавляют гранулированный гидроксид натрия, не допуская при этом сильного разогревания гидролизата. Устанавливают реакцию среды 6-8 по универсальному индикатору (при значении рН выше 9 образуется стойкая эмульсия). Гидролизат экстрагируют смесью хлорформа и изопропилового спирта 8:2 трижды (по 25, 15 и 15 мл) в течение 5 минут каждой порцией. Полученные экстракты соединяют, фильтруют через слой безводного сулфата натрия (1,5 г). Объем экстракта доводят в мерной колбе до 50 мл (V ₁) и используют для обнаружения и количественного определения.

Качественное обнаружение.

Хроматографическое разделение. 2 аликвоты (1,5 и 2/5 части экстракта (V ₂) выпаривают под током теплого воздуха или на роторном испарителе. Остатки преносят с помощью хлороформа на стартовую линию хроматографической пластинки в виде двух полос длинной 1 и 3-4 см на расстоянии 1,5 см друг от друга. На ту же стартовую линию наносят метчик, состоящий из смеси 0,1 % спиртовых растворов бензофенонов производных 1,4 бенздиазепина (МХБ-диазепам, АНБ-нитрозепам, АБХБ-фенозепам, АХБ-хлордиазепоксид) в количестве 10-15 мкг каждого. Подвижная фаза- бензол. Пробег фронта растворителя -10см. Органический растворитель удаляют с хроматограммы под током теплого воздуха в течение 3-5 минут. При концентрации бензофенонов в пятне более 5 мкг их можно обнаружить по собственной желтой окраске. Часть хроматограммы, содержащею 2/5 экстракта, предназначенную для элюирования, закрывают стеклянной пластинкой. На открытой части хроматограммы с пятном метчика и второй полосой исследуемого экстракта (1/5 часть экстракта) проводят реакцию образования азокрасителя. С этой целью хроматографическую пластинку обрабатывают последовательно 2н раствором соляной кислоты, 0,1% раствором нитрита натрия и через 5 минут 0,5% раствором сульфамата аммония или насыщенным раствором мочевины, далее 0,1% раствором b-нафтола в 10 % растворе едкого натра или N- l- нафтилэтилендиаминдихлорида. Величины Rf бензофенонов приведены в таблице №1. Чувствительность 1 мкг препарата в пятне (при использовании N- l- нафтилэтилендиаминдихлорида 2 мкг в пятне)

Необработанную реагентом зону сорбента, содержащею бензофеноны вырезают и проводят элюирование используя этиловый спирт (V₃). Далее снимают спектр в диапазоне волн 200-500нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 7 см.

Таблица 2. Значение величин Rf и λ max продуктов гидролиза производных 1,4 бенздиазепина.

Соединения	Продукт гидролиза	Значения Rf (подвижная фаза бензол)	λ max в УФ- свете в нм
нитрозепам	2-амино-5 нитробензофенон 2,5-диаминобензофенон	0,17-0,18	238,358
феназепам	2-амино-5хлор-бромбензофенон	0,43-0,45	230,400
диазепам	2-метиламино-5-хлорбензофенон (МХБ)	0,57	238,410
2амино-5-хлорбензофенон	0,35-0,37	238,390
хлордиазепоксид	2амино-5-хлорбензофенон	0,35-0,37	238,390

Количественное обнаружение.

В зависимости от концентрации которую орентировочно считают после снятия спектра в УФ, отбирают аликвоту этанолового элюата (V₄) и переносят в стеклянный бюкс. Этанол удаляют под током теплого воздуха, сухой остаток растворяют в 0,2-0,5 мл этанола и добавляют до 3 мл 2н раствора соляной кислоты. Далее последовательно-0,5 мл 0,5% раствора сульфамата аммония. После добавления каждого реагента раствор интенсивно взбалтывают. Азокраситель сиреневого цвета образуется через 15 минут после добавления 1 мл 0,1% раствора N- L-нафтилэтилендиаминдихлорида. Окраска устойчива в течение суток.

Оптическую плотность окрашенного раствора измеряют на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре при 500 нм в кювете толщенной поглощающего слоя 1 см. Концентрацию в органах определяют по формуле:

Х= А •(V₁)• (V₃)•1000•4 / Е^1%_1см •V • 100 • V₄ ; где

 

Х- количество выделенного соединения в мг на 100 г органа;

А- оптическая плотность измеряемого раствора;

Е^1%_{1см -} удельный показатель поглощения (220)

Другие буквенные обозначения указаны в тексте.