Изолирование морфина из тканей внутренних органов.

25 г мелко измельчённой ткани печени или почек (размер частиц не более 0,5-1 см) помещают в колбу со шлифом вместимостью 400 мл, добавляют 10 мл воды и 2,5 мл концентрированной соляной кислоты. Колбу герметично закрывают и автоклавируют при давлении 1,1 атм в течение 30-45 мин, затем охлаждают, переносят в делительную воронку и промывают дважды порциями по 100 мл петролейного эфира (t кип. 30-60⁰С) для освобождения от липидов и жиров. Солянокислый экстракт фильтруют через бумажный фильтр, остаток органов промывают дважды 3% раствором соляной кислоты, снова фильтруют. Для фильтрования можно использовать стеклянные фильтры №3 или №2 укреплённые в колбу Бунзена, с использованием водоструйного насоса. Дальнейшее исследование проводят аналогично исследованию мочи.

Идентификация

Спектрофотометрическое исследование

В УФ-области спектра на спектрофотометре в диапазоне длин волн 230-330 нм исследуют 3 мл солянокислого реэкстракта 0,1 Н раствора соляной кислоты. Морфин в солянокислом растворе имеет максимум поглощения при длине волны 284-287 нм. К солянокислому раствору в контрольной кювете и кювете с исследуемым образцом добавляют по 4 капли 30% раствора гидроксида натрия, перемешивают и исследуют спектр поглощения. В присутствии морфина максимум поглощения смещается к длине волны 296-298 нм и появляется второй максимум при длине волны около 250 нм. Такое смещение характерно для натриевых солей фенолов. Предел обнаружения морфина по характерному спектру поглощения солянокислого реэкстракта составляет около 40-50 мкг/ мл морфина.

Щелочной раствор из кюветы переносят в колбу с солянокислым реэкстрактом, водный раствор подщелачивают сухим карбонатом натрия до рН 8,7-8,8 и экстрагируют двумя порциями по 10 мл смеси хлороформ - изопропанол (8:2). Органическую фазу фильтруют через безводный сульфат натрия, доводят до объёма 20 мл; 1 мл извлечения соответствует 1 мл мочи, 1 г печени или почки. Хлороформный раствор делят на следующие аликвоты: первая – соответствующая 0,1 мл мочи или 0,1 г органа и четыре аликвоты соответствующие 4 мл мочи (или 4 г органа). Полученные остатки исследуют в тонких слоях сорбентов следующим образом: (см. табл. 1 и 2).

 

ТСХ исследование

 

Аликвоту, соответствующую 0,1 мл мочи или 0,1 г органа, хроматографируют в системах растворителей, различающихся по своей полярности:

1 - толуол-ацетон-этанол-25% аммиак, (45:45:7:3);

2 - этилацетат-абсолютный этанол-25% аммиак, (18:6:2);

3 - ацетонитрил-хлороформ-этилацетат-25% аммиак, (40:30:25:5);

4 - этанол - ледяная уксусная кислота - вода, (60:30:10).

5 – ацетон – хлороформ – 25% аммиак, (24:12:1)

 

Таблица 1.

 

Величины Rf опиатов, некоторых наркотичских и некоторых лекарственных веществ при разделении их методом ТСХ на пластинках Сорбфил ПТСХ-ПА «Силуфол»

 

Разделяемые соединения	Хроматографические системы
Героин	0,53	0,73	0,41
6-МАМ	0,48	0,72	0,30
Кодеин	0,36	0,60	0,22	0,32-0,38
Морфин	0,23	0,34	0,08	0,10-0,15
Наркотин	0,70	0,86	0,73	0,45-0,50
Папаверин	0,59	0,81	0,64
Тебаин	0,50	0,69	0,41
Ацетилкодеин	0,55	0,75	0,44
Гидрокодон	0,40	0,65	0,23
Промедол	0,58	0,81	0,55
Анальгин	0,49	0,75	0,48
Антипирин	0,47	0,74	0,45
Делагил	0,44	0,75	0,43
Димедрол	0,60	0,85	0,60
Кокаин	0,73	0,81	0,70
Кофеин	0,49	0,57	0,48
Никотин	0,52	0,80	0,45
норкотинин	0,18	0,46	0,23
котинин	0,32	0,71	0,45
Трамадол	0,77	0,85	0,61
Эфедрин	0,20	0,46	0,12

 

 

Длина пробега фронта растворителя 8-10 см. Пластинку сушат в потоке холодного воздуха и проявляют 0,5 % раствором феррицианида калия, содержащего несколько капель 10% раствора хлорида окисного железа. В зоне, соответствующей морфину, наблюдается синее окрашивание. Проявление следует осуществлять после использования именно 4-й системы растворителей.

При хроматографировании в щелочных и нейтральных системах морфин даёт слабо-фиолетовое окрашивание, исчезающее при стоянии. Нижний предел обнаружения 2-3 мкг морфина. Ярко-синее окрашивание дают фенолы, фенольные стероиды, триптамин и ароматические амины. Исследование соответствующей аликвоты указанным количествам мочи или органов исключает возможность проявления экстрактивных веществ.

При исследовании в данных условиях аликвот, соответствующих 4-5 мл мочи или 4-5 г органа, проявляются экстрактивные вещества с Rf =0,75 и Rf =0,45. Rf морфина – 0,1-0,15 (в 4-й системе).

Аликвоту, соответствующую 4 мл мочи или желчи (или 4 г органа), хроматографируют в системах 1-3 на пластинках «Силуфол», «Сорбфил». Длина пробега фронта растворителя 8-10 см. После хроматографирования пластинку сушат в потоке холодного воздуха и проявляют.

Реактивы проявления:

1. Реактив Драгендорфа в модификации Мунье [4]: раствор 1: 17 г азотнокислого висмута и 200,0 г винной кислоты растворяют в 800 мл воды; раствор 2: 160 г КI растворяют 400 мл воды. Растворы смешивают (полученный «крепкий» раствор является устойчивым несколько месяцев). Перед опрыскиванием хроматограммы к 1 мл «крепкого» раствора добавляют 9 мл 20% раствора винной кислоты.

2. Раствор 10% хлорида окисного железа: 10г хлорида окисного железа (FeCl₃) растворяют в достаточном количестве воды и доводят водой до 100 мл (реакция на фенольный гидроксил). Хроматограмму опрыскивают полученным раствором и наблюдают реакцию в течение не менее 30 минут (при приграничных концентрациях).

3. Раствор ферри-ферроцианида калия [3]: 57,7мг К₃Fe (CN)₆ и 4,9 мг К₄Fe (CN)₆растворяют в 100 мл воды (раствор хранят в холодильнике не более 1 мес. Для опрыскивания хроматограммы к 5мл основного раствора добавляют 3 мл 6% раствора гидроксида аммония и 2 мл этанола. Полученным раствором хроматограмму опрвскивают до увлажнения пластинки, нагревают при 120⁰С 2 мин., затем исследуют в УФ-свете (254-366нм). В случае морфина, а также 6-МАМ наблюдают лимонно-желтую (254нм) и ярко-голубую (366нм) флюоресценцию (образование псевдоморфина). Образование комплекса (при приграничных концентрациях) наблюдают не ранее чем через 30-40 минут. Морфин проявляется по сине-голубой, при стоянии - салатовой флуоресценции. Данная реакция достаточно специфична: не дают флуоресцирующих пятен морфинон, кодеин и его производные, дигидроморфинон, диацетилморфин, апоморфин, меперидин, метадон, апиперидин. Флуоресцирующие пятна образуют нор-морфин, п-аллил-нор-морфин, дигидроморфин, 6-ацетилморфин, наркотин, но разделяются при хроматографировании. Экстрактивные вещества, при исследовании указанной аликвоты, в зоне морфина по данной реакции флуоресцирующих пятен не образуют. Нижний предел обнаружения морфина 50-80 мкг. В случае слабой флуоресценции необходимо ещё несколько раз опрыснуть пластинку реактивом. Флуоресценция усиливается, пятна, соответствующие морфину, после проявления приобретают через сутки желтоватую окраску, заметную при дневном освещении и сохраняют свою флуоресценцию.

4. Пробу с реактивом Скотта (тиоцианат кобальта) проводят в модификации на пластинке ТСХ. Приготовление: 6,0г нитрата кобальта и 18,0г роданида калия (тиоцианата калия) растворить в 100 мл воды. голубое окрашивание дают многие алкалоиды и синететические основания (кроме никотина, анальгина, амидопирина, кофеина, бензофенонов)

5. Пробы Марки-Манделина и Марки (8): примерно 25 мл формальдегида в чашке помещали в стеклянную камеру (время насыщения не менее 30 минут). В камеру опускают хроматограмму, экспонируя ее в парах формальдегида в течение 5 минут, вынимают ее и сушат в течение 30сек при 50⁰ С. Затем опрыскивают (под тягой) или обрабатывают методом погружения концентрированной серной кислотой или концентрированной серной кислотой, содержащей ванадат аммония (проба Марки-Манделина). Наблюдают окраску пятен, отмечают их карандашом, затем погружают пластинку в воду и быстро удаляют ее. При этом окраска пятен бледнеет. Для приготовления реактива Манделина, 200 мг ванадата аммония растворяют в 350 мл 95-97% серной кислоты.

6. Реактив Мекке (раствор селенистой кислоты или селенита натрия в концентрированной серной кислоте) [7], как и реактив Марки очень чувствителен в отношении алкалоидов опия, однако обладает более высокой изби-рательностью в отношении опиатов, позволяя определять их в присутствие экстрактивных веществ. Приготовление: 0,25 г селенистой кислоты (0,34г селенита натрия) растворить в 25 мл концентрированной серной кислоты.

Таблица 2.

Реакции обнаружения опиатов, некоторых наркотических и лекарственных веществ и наблюдаемые окраски при ТСХ-анализе на пластинках Сорбфил ПТСХ-ПА в системах растворителей 1 - 5.

 

Исследуемый препарат	Реактивы и результаты реакций (окраска пятен)
Реактив Драгендорфа	Реактив Марки- Манделина	К3Fe(CN)6+ К4Fe(CN)6 +УФ-свет 254-366 нм	Раствор тиоцианата кобальта (р-в Скотта)	Реактив Мекке	10% раствор Fe Cl3
Героин	оранжево- коричневое (0,2)	темно- фиолетовое (0,2)	-	голубое (0,3)	зелено-голубое (0,2)	-
6-МАМ	оранжево- коричневое (0,2)	синее (0,3)	Желто-серое свечение (0,4)	То же	-	голубое (3-5 мкг)
Кодеин	То же	Темно-синее (0,3)	- *	,,,,	зелено-синее	-
Морфин	,,,,	фиолетовое (0,25-0,3)	голубая флюоресцен-ция (0,2)	,,,,	зеленое (0,2)	синее (1,0)
Наркотин	,,,,	темно-фиолетовое	Слабая голубоватая флюоресцен –ция (100)	,,,,	сине-зеленое	-
Папаверин	,,,,	пурпурно-фиолетовое	-	,,,,	синее	-
Промедол	,,,,	малиновое	-	,,,,	-	-
Анальгин	оранжево- светло-коричневое	,,,, (после разбав-ления водой)	-	-	-	малиновое
Антипирин	То же	,,,,	-	-	-	бордовое
Димедрол	коричневое	лимонно-желтое	-	голубое	желтое	-
Делагил	коричневое	-	фиолетовая** фл-я (в амми-ачной среде)	,,,,	-	-
Кокаин	темно- коричневое	-	-	,,,,	-	-
Кофеин	темно-фиолетовое	-	-	-	-	-
Никотин норкотинин котинин	коричневое для всех 3-х соединений	-	-	-	-	-
-	яркая флюор-я	-	-	-
-	-	-	-	-
Трамадол	коричневое	Коричневое, переходящ. в бирюзовое	-	голубое	серо-голубое	-
Эфедрин	Светло-коричневое	-	-	сиреневое	-	-
Экстрактивные вещества	коричневое	Темнокорич-нево-бурое	Голубая флю-оресценция	темно-зеленое	коричневое	буро-ко-ричневатое

 

Примечание: Прочерк - отсутствие окрашивания; в скобках указаны пределы детектирования вещества (в мкг); * - желто-зеленая флюоресценция кодеина проявляется после обработки реактивом Марки, промывания и высушивания пластинки; ** - флюоресценция делагила проявляется в аммиачной среде без обработки ферри-ферроцианидным реактивом.

 

Пределы обнаружения опиатов в моче и внутренних органах методом ТСХ по разработанной методике анализа при использовании всего комплекса хромогенных реакций (при максимальной аликвоте, эквивалентной 0,5мл исследуемой мочи или 1,0 г ткани органов) составляют: для морфина - 1-5мкг/мл мочи (1-5 мкг/г ткани органов): для кодеина и героина - 1-2 мкг/мл мочи (1-2мкг/г ткани органа).

Пределы обнаружения опиатов в моче отдельными реагентами составляют: для морфина, кодеина, и героина при использовании реактива Драгендорфа - 0,5 мкг в пробе, при применении пробы Марки или Марки-Манделина - 1мкг в пробе; для морфина при обнаружении реакцией образования псевдоморфина - 1 мкг в пробе, при детектировании с хлоридом окисного железа - 2,5 мкг в пробе.

 

При исследовании загнившего трупного материала наряду с морфином можно обнаружить псевдоморфин, который также изолируется по описанной методике. В солянокислом растворе он имеет максимум поглощения при 261 нм, а при подщелачивании наблюдается батохромный сдвиг максимума не более, чем на 2-3 нм. Во всех описанных хроматографических системах псевдоморфин отделяется от морфина, имеет меньшую величину Rf по сравнению с морфином на 0,15-0,20, имеет голубовато-салатную флуоресценцию до проявления раствором ферри-ферроцианида калия. При проявлении реактивом Марки образуется зелёное окрашивание, всеми остальными реактивами – аналогичное морфину. Заключение об обнаружении псевдоморфина дают на основании результатов ТСХ и УФ – спектрофотометрии. Количественное определение не проводят.