Ультраструктурная организация клеточной мембраны

Под электронным микроскопом мембрана имеет вид трехслой­ной структуры — два темных слоя по краям и один светлый в сере­дине — «прозрачный» для электронов; толщина ее около 10 нм. К настоящему времени структурная организация нервной мембраны до конца не выяснена. Вместе с тем использование различных фи­зических и химических методов позволило создать несколько мо­делей клеточной мембраны. На рисунке 2.4, Б представлен фраг­мент строения мембраны в соответствии с твердокаркасной жид-костно-мозаичной моделью. Мембрана состоит главным образом из липидов и белков с примесью углеводов. Липиды представлены фосфолипидами или гликолипидами. Жирно-кислотный состав липидов весьма разнообразен, однако преобладают в них пальми­тиновая и олеиновая кислоты. Изучение структуры молекул ли­пидов показало, что они имеют полярные «головки» и неполяр­ные «хвосты», т. е на одном конце молекулы имеются заряженные ионные группы, а другой конец является электронейтральным. Сочетание в молекулах липидов двух частей определяет их способ­ность образовывать мембраны. Полярные головки молекул стре­мятся контактировать с водой, а неполярные хвостовые части избегают таких контактов и притягиваются друг к другу благода­ря ван-дер-ваальсовым взаимодействиям. В результате образуются пленки, состоящие из двух слоев липидных молекул. Таким обра­зом, молекулы липидов идеально подходят для образования разде­ла между неводной фазой внутри мембраны и водными внутри- и внеклеточными пространствами.

Мембранные белки подразделяют на две большие группы в зависимости от характера взаимодействия с бислоем липидов. Первая группа — это периферические белки, которые взаимо­действуют с полярными поверхностными частями липидов элек­тростатически (см. рис. 2.4, Б). Вторая группа — интегральные белки, в которых много неполярных аминокислотных остатков, взаимодействующих с гидрофобной внутренней областью бислоя мембраны (т. е. хвостами липидов) с помощью ван-дер-ваальсо-вых сил. Возможны следующие варианты расположения интеграль­ных белков в мембранах (см. рис. 2.4, Б): белок полностью по­гружен в бислой; сравнительно небольшая гидрофобная часть белка погружена в мембрану, пересекая при этом всю ее толщину, а большая (гидрофильная) часть обращена в водную среду; гид­рофобная часть белка (гидрофобный «якорь») проникает только на глубину фосфолипидного монослоя.

По функциям периферические белки делятся на регуляторно-сигнальные (белки внеклеточного матрикса: фибронектин, лами-нин, коллаген), структурно-каркасные (актин-спектриновые ком­плексы), обеспечивающие подвижность внутриклеточных струк­тур и отдельных клеток (белки микротрубочек и микрофиламен-

 

1*

Рис. 2.4. Схема регистрации мембранного потенциала (А) и фрагмент клеточной мембра­ны (Б) нервной клетки:

А: 1 — нервная клетка; 2— микроэлектрод; 3 — электрод сравнения; Д,_х — входное сопротивле­ние регистрирующей системы; стрелками показано направление движения регистрируемого ионного тока; Б: 7 —липидный бислой; 2— интегральные белки; 3 — ионный канал; 4— эле­мент спектриновой сети; 5 — коммутационные белки

тов). Среди основных функций интегральных белков можно выде­лить транспортную, рецепторную и ферментативную. Транспорт­ные белки осуществляют перенос ионов и незаряженных молекул через мембрану, они формируют каналы пассивного и активного транспорта. Рецепторные (т. е. воспринимающие) белки чрезвычай­но разнообразны и участвуют в восприятии различных химических и физических стимулов, воздействующих на клетку. Ферментатив­ные белки обеспечивают биохимические реакции, протекающие на клеточных мембранах. Согласно модели (см. рис. 2.4, Б) липидный бислой заполняет ячейки каркаса, образованные связанными меж­ду собой определенным образом периферическими и интегральны­ми белками. Вместе с тем часть белков не входит в состав каркаса, а находится в свободном состоянии. Структура белкового каркаса динамична и в зависимости от физиологического состояния клет­ки может изменяться в результате включения или удаления различ­ных структурных и функциональных (рецепторы, ферменты) эле­ментов. Таким образом, по современным представлениям клеточ­ная мембрана имеет довольно сложную структуру, может выпол­нять многочисленные и чрезвычайно важные операции для функционирования клетки, и в том числе для ее возбуждения.

ПОТЕНЦИАЛ ПОКОЯ

В течение длительного времени потенциал покоя измерялся как потенциал повреждения, т. е. регистрировалась разность потенци­алов между участком нервной или мышечной ткани, где клеточная мембрана была разрушена, и участком интактной мембраны. По этим измерениям нельзя было судить об абсолютной величине потенциала покоя, поскольку невозможно избежать шунтирова­ния регистрирующих электродов из-за того, что часть тока, вели­чину которой трудно оценить, распространялась от поврежден­ного участка по тонкому слою жидкости к интактным областям ткани, минуя регистрирующие электроды. Кроме того, потенциал повреждения быстро уменьшался со временем.

Величину потенциала покоя стало возможным измерять с вы­сокой точностью с введением в 50-е годы XX в. Грэхемом, Лингом и Джерардом в практику электрофизиологического эксперимента микроэлектродов — микросолевых мостиков. Микроэлектроды из­готовляются из тонких стеклянных трубочек с оттянутым на од­ном конце кончиком, диаметр которого составляет доли микрона. Микроэлектрод заполняется концентрированным солевым раст­вором, например 3-молярным КС1. Со стороны широкого конца в трубочку вставляется металлическая проволока — платиновая или серебряная.

Для того чтобы избежать поляризации металла в солевом раст­воре, т. е. возникновения на регистрирующих электродах проти­воположно направленной измеряемому потенциалу электродви­жущей силы, и тем самым исключить искажения в регистрации потенциала, на поверхность металла наносят тонкий слой его соли электролитическим методом. Например, в случае серебра — хлорид серебра. Такое покрытие создает значительный запас ионов Ag⁺ и С1~ на поверхности проволочки и служит проме­жуточным звеном между электронной проводимостью в металле (Ag⁺ + e~-»Ag) и ионным током, который обусловлен обменом ионами С1~ между слоем AgCl и раствором. Вследствие этого ста­новится возможным двусторонний поток электрических зарядов от электронов в металле к ионам хлора в растворе и в обратном направлении без возникновения на электродах обратнонаправ-ленной электродвижущей силы. Такие электроды получили назва­ние неполяризующихся.

Для работы с микроэлектродами были разработаны электрон­ные усилители постоянного тока, которые работают в электро­метрическом режиме, т.е. имеют очень большое входное сопро­тивление и потребляют чрезвычайно малый ток от измеряемого источника ЭДС. Для измерения постоянных или медленно изме­няющихся потенциалов к выходу усилителя можно подключить стрелочный индикатор, однако для регистрации быстрых измене­ний потенциала используют безынерционные электронные ос-

 

циллографы. С целью измерения потенциала покоя кончиком микроэлектрода прокалывают мембрану клетки, второй электрод (электрод сравнения) — также неполяризующийся электрод — по­мещают рядом с исследуемой клеткой. Его конструкция может быть самой различной: в простейшем случае это просто хлориро­ванная проволочка. Нужно отметить, что прокалывание мембра­ны кончиком микроэлектрода клетки также, по сути, наносит клетке повреждение, но, как продемонстрировали многочисленные исследования, оно минимально. Подтверждением этого является тот факт, что регистрируемый потенциал может держаться на не­изменном уровне в течение нескольких часов. Предполагается, что клеточная мембрана в месте входа микроэлектрода плотно обхватывает его стенки, предупреждая появление шунтирующего ионного тока вдоль наружной поверхности стеклянного кончика. Микроэлектродные измерения различных типов клеток животных показали, что потенциал покоя или, как лучше называть разность потенциалов на клеточной мембране — мембранный потенциал, имеет отрицательный знак внутри клетки (рис. 2А,А). Учитывая, что в наружной цепи источника ЭДС электрический ток течет от положительного полюса к отрицательному, ток через мембрану будет распространяться к электроду сравнения (внеклеточному), т. е. к наружной поверхности мембраны. В месте соединения соле­вой раствор/металл (AgCl/Ag) ионная проводимость переходит в электронную. Электронный ток на входном сопротивлении уси­лителя R_BX создаст падение напряжения, очень близкое по вели­чине к мембранному потенциалу клетки. Затем поток электронов в месте контакта Ag/AgCl, находящемся в стеклянной трубочке, переходит в поток ионов и через кончик микроэлектрода вхо­дит в клетку, замыкая цепь. Таким образом, измерения мембран­ного потенциала с помощью микроэлектродов подтвердило тео­рию Дюбуа-Реймона о том, что разность потенциалов через мемб­рану преформирована и не является результатом повреждения протоплазмы клетки. Преимущество микроэлектродного метода состоит в том, что можно исследовать мелкие клетки и проводить эксперименты на отдельных клетках, находящихся в организме без их изоляции.

Попытаемся теперь выяснить, каким образом устанавливается через мембрану, имеющую избирательную проницаемость к оп­ределенным ионам, разность потенциалов и как можно вычислить ее величину. Начнем с идеального случая. На рисунке 2.5 видно, что два раствора солей разделены мембраной. Раствор во внутрен­нем объеме (А) содержит 100 мМ КС1 и 10 мМ NaCl, снаружи (Б) — 100 мМ NaCl и 10 мМ КС1. Мембрана имеет каналы, диа­метр которых позволяет проходить через них только гидратиро-ванным (т.е. окруженным оболочкой из молекул воды) ионам ка­лия и молекулам воды. Гидратированные ионы натрия, превыша­ющие в 1,5 раза диаметр гидратированных ионов калия, не прохо-

 

Рис. 2.5. Образование потенциала через идеальную мембрану:

Л —внутренний объем, ограниченный мем­браной; Б— внешний объем; Лвх — входное сопротивление регистрирующей системы; стрелками показано направление ионного тока, пунктирной линией — уровень раствора

дят через данные каналы. Кро­ме того, на внутренних стенках этих каналов располагаются фик­сированные отрицательные заря­ды, что препятствует прохож­дению через них отрицательно заряженных ионов хлора. При данных условиях из объема А в объем Б через каналы по своему концентрационному градиенту могут проходить только ионы калия. Но диффузии происхо­дить не будет. Причина заклю­чается в том, что ионы калия — положительно заряженные час­тицы. Движение только ионов калия в объем Б приведет к увеличению в нем положи­тельно заряженных частиц, что сразу же проявится в возник­новении задерживающей их по­ложительной электростатичес­кой силы. Через мембрану воз­никнет разность потенциалов соответственно с положительным знаком снаружи и отрицательным внутри объема А, которую мож­но измерить с помощью описанной ранее регистрирующей систе­мы. Добавление NaCl в растворы по обе стороны мембраны обес­печивает поддержание осмотического равновесия. При отсутствии NaCl возникло бы гидростатическое давление или же в случае податливости мембраны осмотический ток воды в объем А из объема Б. Таким образом, между объемом А и объемом Б, разде­ленными мембраной, установится электрохимическое равновесие, обусловленное равенством электрической работы, необходимой для перемещения небольшого количества заряженных частиц — ионов в одном направлении и осмотической работой, затраченной для перемещения того же количества ионов, в противоположном направлении. Известно, что электрическая работа А_э, необходи­мая для переноса 1 моль ионов К⁺ против разности потенци­алов Е, равна произведению заряда Q этого количества ионов на разность потенциалов:

A₃=QE, (1)

но Q = nF, где п — валентность ионов (в данном случае она рав­на 1), a F— число Фарадея. Следовательно,

А_э = EF. (2)

Осмотическую работу, необходимую для перемещения 1 моль ионов калия из области концентрации [К⁺]_Б в область, где его концентрация [К⁺]_А в 10 раз выше, легче всего оценить, проведя аналогию с работой по сжатию 1 г • экв идеального газа до 1/10 его первоначального объема. Идеальный газ состоит из частиц (моле­кул), не взаимодействующих друг с другом. Сжатие газа произво­дится очень медленно, без изменения его температуры. Предста­вим, что газ находится в цилиндре с подвижным поршнем. Меха­ническая работа А_м равна произведению силы F на расстояние /: А_м — FI. В данном случае для очень малого перемещения А/ порш­ня действующая сила F равна произведению давления Р газа на площадь S поперечного сечения. Отсюда произведенная работа при малом перемещении поршня

ДА, = PSM. (3)

Учитывая, что произведение SA/— элементарный объем А К,

AA_M=PAV. (4)

При медленном увеличении силы, действующей на поршень, произведенная работа по сжиманию идеального газа от объема V\ до объема V₂, меньшего в 10 раз объема V\,

A_M = \PdV. (5)

Согласно формуле Менделеева — Клайперона давление и объем газа связаны между собой обратно пропорциональной зависи­мостью:

PV = RT, (6)

Р = RT/V, (7)

где R — универсальная газовая постоянная; Т— температура.

Отсюда механическая работа

A_M = \RT&V_X/V. (8)

Вычисляя определенный интеграл, получим, что

А, = RT(\n V_{ - In V₂) = RT]n V_x/ V₂. (9)

Отметим, что при сжатии газа с уменьшением его объема про­исходит увеличение концентрации его молекул. Поскольку между объемом и концентрацией существует обратно пропорциональная зависимость V— 1/[С], можно переписать формулу (9)

А_м= RTlniCh/iQi. (10)

Приведенные рассуждения применимы к вычислению осмо­тической работы, выполняемой при увеличении концентрации молекул растворенного вещества, т. е. при перемещении моле­кул в область их более высокой концентрации. Эту ситуацию легко смоделировать, представив, что в цилиндре находится не газ, а раствор с ионами и поршень сделан из полупроницае­мой неподатливой (не изменяющей свои размеры) мембраны (см. рис. 2.5). Допустим, первоначально по обе стороны порш-нямембраны находится раствор, в котором концентрация КС1 составляет 10 мМ. Затем начнем медленно увеличивать давле­ние таким образом, чтобы молекулы воды по каналам успева­ли выходить из объема А в объем Б без повышения температу­ры раствора. При достижении определенного давления на пор­шень-мембрану концентрация КС1 в объеме А увеличится в 10 раз. Осмотическая работа

Ло = ДЛп[С]_Б/[С]_А. (11)

Ионы К⁺ в соответствии с разностью их концентраций будут стремиться диффундировать через каналы поршня. Поскольку они являются заряженными частицами, увеличение количества положительно заряженных частиц, не скомпенсированное с от­рицательно заряженными частицами, вызовет возникновение задерживающей их электростатической силы. Возникший по­тенциал компенсирует «диффузионное давление». В этом случае, как уже говорилось,

А_э = Ао. (12)

Подставляя значения, получаем

EF = ДГ1п[С]_Б/[С]_А. (13)

Отсюда потенциал через мембрану

Е = (RT/F)\n([C}_B/[C]_A) или £аб = (RT/F)\n[K⁺]_b/[K⁺]_A. (14)

Это уравнение было выведено физикохимиком Нернстом и но­сит его имя. Следует отметить, что уравнение Нернста — самое из­вестное и наиболее используемое. Приведен его первоначальный вывод, который базируется на простых термодинамических прин­ципах, определяющих электрохимическое равновесие. Как сле­дует из уравнения, потенциал через мембрану зависит от темпе­ратуры и концентрации только ионов К⁺ по обе стороны мембра­ны. Этот потенциал получил еще и название равновесного по­тенциала, поскольку он уравновешивает разность концентраций ионов через мембрану.

 

Перейдя от натуральных логарифмов к десятичным и под­ставив значения универсальной газовой постоянной и числа Фарадея, можно вычислить величину потенциала при темпе­ратуре 18 °С:

Е = 0,058 lg[ 10] /[100];

Е= 0,058 lg 0,1 = 0,058 (-1);

Е = -0,058 В = -58 мВ.

Таким образом, согласно расчету по уравнению потенциал имеет знак «минус».

От рассуждений о ситуации с идеальной мембраной перейдем теперь к примеру, более приближенному к реальным условиям: мембране между двумя объемами, пропускающей несколько ионов. На рисунке 2.6 изображены две ячейки, разделенные данным ти­пом мембраны. Отметим также, что мембрана и стенки ячеек спо­собны выдерживать большое гидростатическое давление. В исход­ном состоянии концентрации ионов К⁺ и С1~ в обеих ячейках одинаковы и находятся в равновесном состоянии. При добавле­нии в ячейку А калиевой соли, анион которой не способен про­ходить через каналы, в мембране происходит перераспределение ионов К⁺ и С1~. Ионы К⁺ будут выходить из ячейки А в ячей­ку Б. По аналогии с первым случаем (см. рис. 2.5) изменение кон­центрации заряженных частиц по обе стороны мембраны вызовет возникновение электростатической силы с отрицательным знаком со стороны ячейки А, которая заставит ионы С1~ перемещаться в ячейку Б, хотя движение С1~ будет происходить против образую­щегося и возрастающего концентрационного градиента. Этот про­цесс будет продолжаться до тех пор, пока разность концентраций,

РАВНОВЕСИЕ

		rJ	}i
Б		^А V»
к^+4	f^K+
сг^	&СГ

Добавляем калиевую соль аниона (An), не­способную проходить че рез мембрану в ячейку А

Рис. 2.6. Схема ионного равновесия Доннана: Двх — входное сопротивление регистрирующей системы; стрелками показано направление ионного тока, пунктирной линией — уровень раствора

РАВНОВЕСИЕ

заставляющих ионы К⁺ переходить из ячейки А в ячейку Б, не будет уравновешена противоположно направленной силой, за­ставляющей переходить ионы С1~ из ячейки Б в ячейку А. Две силы уравновесят друг друга тогда, когда отношение концентра­ций для К⁺ и С1~ по обе стороны мембраны будет удовлетворять равенству

[К⁺]_А/[К⁺]_Б = [С1-]_Б/[С1-]_А. (15)

Это явление названо равновесием Доннана, по имени Ф. Дон­нана, который в начале XX в. впервые исследовал распределение ионов в данной системе. Общая осмотическая концентрация в объеме А выше, чем в объеме Б, но стремление молекул воды переходить в объем А по своему концентрационному градиенту будет сбалансировано развившемся в объеме А гидростатичес­ким давлением, равным разности осмотических давлений с двух сторон мембраны. Во время равновесного состояния стремле­ние К⁺ переходить из ячейки А в ячейку Б будет равно стрем­лению С1~ переходить из ячейки Б в ячейку А. Однако ионы перемещаться не будут, поскольку этому препятствует обра­зование разности потенциалов между двумя сторонами, кото­рая уравновешивает концентрационные градиенты этих ионов. Величина этой разности потенциалов определяется по формуле Нернста

Е = RT/F[K⁺]_S/[K⁺]_A = RT/Fln [С1-]_А/[С1-]_Б. (16)

Исследования потенциала покоя у различных клеток (главным образом нервных и мышечных) с помощью микроэлектродов под­твердили справедливость основных положений мембранной тео­рии. Так, экспериментально замеренные потенциалы покоя в ряде случаев были близки по значению с рассчитанным равновесным потенциалом для ионов калия. Вариации наружной концентрации ионов калия вызывали изменения в величине потенциала покоя, совпадавшие с вычисленными по уравнению Нернста, а измене­ния концентрации ионов натрия в окружающей клетку среде не нлияли на величину потенциала покоя. В то же время были полу­чены данные, что мембраны, окружающие клетки, в отличие от идеальной мембраны пропускают в той или иной степени не один или два иона, а все неорганические ионы, находящиеся в окружа­ющей клетку наружной среде, и поэтому представляют собой бо­лее сложные системы. Напомним, что электрохимический гради­ент того или иного иона не влияет на мембранный потенциал, если этот ион не способен проникать через мембрану, т.е. перено­сить заряды с одной стороны мембраны на другую. Кроме того, оказалось, что мембранный потенциал не будет зависеть от элект­рохимического градиента иона и в том случае, если его проницае­мость через мембрану во много раз меньше легко диффундирую-

 

щего иона. Таким образом, относительная способность различных ионов к диффузии через мембрану определяет их вклад в потенци­ал, возникающий в результате диффузии. Приняв во внимание это положение, а также упрощенное допущение о том, что уменьше­ние потенциала при переходе от одной поверхности мембраны к другой происходит равномерно, Д. Голдман в начале 40-х годов XX в. на основании уравнения Нернста вывел новое уравнение, учитывающее относительную проницаемость мембраны для всех диффундирующих ионов:

Е_м = RT/F\nP_K[K⁺}₀ + /WNa⁺]₀+ Р_а[СГ],/Рк[К⁺],+

+/WNa⁺], + Р_а[СПо, ^(1?)

где Р — проницаемость для основных ионов, присутствующих во внутри- и вне­клеточной среде; / — внутриклеточная концентрация ионов; 0 — экстраклеточная концентрация ионов. Поскольку валентность всех ионов равна 1, то п ■ F= 1 • F~ F.

Проницаемость определяется как отношение потока каких-
либо частиц (нейтральных молекул, ионов) к их концентрации
и характеризует скорость, с которой частицы проходят через
мембрану в заданных условиях. Поток частиц можно представить
как количество растворенных частиц (моль), которые пересекают
единицу площади мембраны (см²) каждую секунду (моль/см² • с).
Концентрация вещества в каком-либо объеме будет измеряться
как моль/см³. Поэтому размерность проницаемости будет выра­
жаться как моль/см²: с/моль/см³ =см/с, т. е. имеет размерность
скорости. В соответствии с уравнением Голдмана вклад каждого
иона в потенциал покоя или, как часто его называют, мембранный
потенциал, будет тем меньше, чем меньше его проницаемость че­
рез мембрану. Кроме того, снижение концентрации иона также
уменьшает его вклад в мембранный потенциал. Это хорошо иллю­
стрирует рисунок 2.7, на кото­
ром представлена зависимость
мембранного потенциала мышеч­
ного волокна лягушки от вне­
клеточной концентрации ионов
калия. При высоких значениях
-40V- / концентраций ионов калия на-

-60

__во _ о/ Рис. 2.7. Зависимость потенциала покоя

мышечного волокна от концентрации ионов калия во внеклеточной среде:

1 — теоретическая зависимость, рассчитанная

по формуле Нернста; 2— кривая, построен-

0 020510255 10 20 50 100 ^{ная по} экспериментальным данным; по оси

' ' ' ' ги+1 м абсцисс — концентрация ионов калия; по оси

L l\ Jg, мм ординат — величина мембранного потенциала

клон кривой совпадает с теоретически рассчитанной и имеет, как и в случае с идеальной мембраной, наклон 58 мВ на десяти­кратное увеличение содержания ионов калия. При низких кон­центрациях кривые начинают расходиться из-за влияния ионов натрия, хотя проницаемость для этих ионов, определенная в опытах с радиоактивными изотопами, примерно в 100 раз мень­ше, чем ионов калия. Произведение i^>Na[Na⁺]₀ численно начи­нает приближаться к произведению Рц\ К⁺]₀. Следует учиты­вать, что ионы хлора в мышечных волокнах лягушки распреде­ляются пассивно в соответствии с величиной и знаком мем­бранного потенциала, т.е. отсюда следует, что не ионы хлора вносят вклад в мембранный потенциал, а мембранный потен­циал определяет распределение ионов хлора. Поэтому при рас­чете мембранного потенциала в данном случае ионами хлора можно пренебречь. Вместе с тем исследования показали, что в других клетках ионы хлора не находятся в состоянии электро­химического равновесия по разные стороны мембраны и вносят соответствующий вклад в создание мембранного потенциала. Учитывая этот факт, уравнение Голдмана можно записать в уп­рощенном варианте:

Е* = RT/F 1пР_к[К⁺]₀ +^а^а⁺]₀/Р_к[К⁺], + P_Na[Na⁺],- =

(18) = 0,0581gl[2,5] + 0,013[120]/1[140] + 0,013[10] = -89 мВ.

При физиологических значениях ионов калия в окружаю­щей среде 2,5 мМ равновесный потенциал покоя по уравнению Нернста

E_K=RT/F- In [K⁺]₀/[K⁺] = 0,058 lg 2,5/140 = -102 мВ.

Значение Е_м — —89 мВ заметно отличается от значения рав­новесного потенциала для ионов К⁺и согласуется со значением Е_м = —90 мВ, полученным при микроэлектродных измерениях мембранного потенциала мышечной клетки.