Реакции связывания комплемента. (РСК)

Сложные двухэтапные серологические реакции. Используют 5 ингредиентов, составляющих 2 системы.

а) антиген, антитело, комплемент

б) эритроциты барана, сенсибилизированные гемолитической сывороткой содержащей специфическое к ним антитело. Общее правило постановки реакции:

Исследуемая сыворотка подогревается на водяной бане до 50 градусов в течение 30 минут для активации собственного комплемента и разводится, начиная с 1:5 и т.д.

Антигеном является культуры бактерий, их лизиты, вирусы и вируссодержащие материалы

Комплемент - сыворотка морских свинок (сейчас применяют сухой комплемент)

Гемолитическая система состоим из смешанных в равном объеме гемолитической сыворотки в тройном тигре и 3% взвеси эритроцитов барана по осадку.

Реакцию ставят в объеме 2,5 миллилитров, из каждого ингредиента добавляя рабочую дозу, содержащую 0,5 мл.

В первую пробирку вносят сыворотку антиген и комплемент (первая система) Во вторую - сыворотку, комплемент и изотонический раствор. Вторая и третья пробирка - контрольные. Пробирки ставят в термостат на I час при температуре 37 градусов. Одновременно готовят гемолитическую систему, смешивая поровну гемолитическую сыворотку в тройном титре и 3% взвесь эритроцитов барана, которые добавляют по I мл во все три пробирки, после извлечения штатива из термостата. Затем их вновь ставят в термостат на 1 час.

Реакцию отмечает +.

1. + -слабоположительная реакция, жидкость равномерно окрашена, на дне пробирки не значительное количество эритроцитов.

2. ++ положительная реакция, жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки небольшое количество эритроцитов.

3. +++ положительная реакция, жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки большое количество эритроцитов.

4. ++++ резко положительная реакция, жидкость прозрачная, эритроциты повреждены все.

5. - реакция отрицательная, полный, гемолиз эритроцитов, жидкость интенсивно окрашена.

РСК, несмотря на её сложность, очень чувствительная специфическая реакция и широко применяется для диагностики многих инфекционных заболеваниях.

Реакции иммунофлюоросцентции. (РИФ).

Выделяют прямую и непрямую РИФ.

А). Прямая РИФ - простая реакция, но требующая большое количество меченых антимикробных сывороток.

Б). Непрямая РИФ - более сложная, но нужна одна меченая сыворотка.

При этом антиген с начало обрабатывают обычной иммунной сывороткой, а затем к иммунному комплексу добавляют меченую флюоросцентную сыворотку

Обычно идентификация антигена на первом этапе проводят иммунной кроличьей сывороткой. На втором этапе используется меченая сыворотка, полученная путем иммунизации иммуноглобулином кроликов и других животных.

А). Прямая РИФ.

На обезжиренном предметном стекле из исследуемого материала делают тонкие мазки-отпечатки, подсушивают и фиксируют, затем наносят сыворотку и помещают во влажную камеру на 20-30 минут при температуре 37 градусов. Вынимают, уделяют избыток диагностической сыворотки, промывают 10-15 минут физиологическим раствором, ополаскивают дисцилированной водой и сушат, после чего исследуется в люминесцентном микроскопе.

Оценку производят +.

1. ++++ - очень яркое свечение вокруг микроорганизмов.

2. +++ - яркое свечение вокруг микроорганизмов.

3. ++ - обычная флюоресценция.

4. + - слабое свечение

 

Реакции лизиса (растворения)

Антиген – лизис обладает способностью растворять соответствующие микробные клетки. Лизисы способны на это только в присутствии комплемента.

 

Обнаружение возбудителей вирусных инфекций.

Наличие вируса в эмбрионе определяют с помощью 2 реакций:

Реакция связывания компонента.

Реакция гемагглютинации

Чаще применяется реакция гемагглютинации. В основе реакции лежит адсорбция вируса на поверхности эритроцитов, с дальнейшим их склеиванием. Активную гемагглютинацию вызывают вирусы гриппа, парагриппа и оспы. Иногда применяют реакцию торможения гемагглютинации – противоположную реакцию, тормозящую склеивание эритроцитов.

Наличие вирусов в культуре тканей чаще определяют с помощью двух реакции:

Реакция нейтрализации вирусов на культуре клеток.

Реакции торможения гемагглюнации (Р.Т.Г.А)

Реакция нейтрализации вирусов на культуре клеток.

Обычно используются нейтрализующие сыворотки.

Для этого полученный вирус накапливают в культуре клеток, и различные его разведения смешивают с не разведенной противовирусной сывороткой или делают наоборот – разводят сыворотку. Смесь инкубируют в термостате при 37 градусах 1-2 часа.

После этого смесью заражают культуру клеток, куриные эмбрионы или чувствительных животных и следят за реакцией. Отсутствие лизиса в культуре клеток тканей и патологических изменений в эмбрионе говорит о гибели вирусов, что и подтверждает достоверность поставленного диагноза.

Можно так же в серологической диагностике Р.Н.В. вводить вирусонейтролизующие антитела в организме больного человека с помощью известных диагностических штампов вирусов.

Обычно применяют метод «парных сывороток». О заболевании говорит 4-х и более кратное нарастание титра сывороток.

Реакция гемагглютинации.

В лунках планшета готовят 2-х кратно возрастающее разведение материала. Жидкость, в объеме 0,5 миллилитров, добавляя 0.25 миллилитров эритроцитов. Для контроля такую же смесь эритроцитов готовят в изотермическом растворе. Смеси культивируют в инкубаторе при температуре 37 градусов 30-60 мин. Результаты РГА по характеру агглютинации эритроцитов +.

1. ++++ - эритроциты в виде звездочки в осадке.

2. +++ - осадок с просветом.

3. ++ - осадок с большим просветом.

4. + - хлопьевидный осадок.

5. - - эритроциты в осадке в виде пуговицы.

РГА является группоспецифической, и не дает возможность определить вид вируса. Для этого применяют реакцию торможения гемагглютинации.

Реакции торможения гемагглютинации (Р.Т.Г.А)

Многие вирусы обладают способностью агглютинировать эритроциты строго определенных млекопитающих и птиц.

Вирусы гриппа и гепатита – эритроциты кур, морских свинок, человека.

Аденовирусы – эритроциты крыс и мышей и т.д.

Для обнаружения вирусов во взятом материале от больного применяют реакцию торможения гемагглютинации, т.е. реакцию противоположного типа (РГА)

РТГА также проводят на пластмассовых планшетах и чаще ее применяют для диагностики ОРВИ и гриппа с разными сыворотками. 4-х кратное нарастание титра подтверждает предполагаемый диагноз.

Иммунологические исследования.

Исследуется иммунологический статус организма. В лаборатории работают в перчатках, масках, строго соблюдая правила безопасности.

Кровь для иммунологического исследования берётся, так же как и для серологического, но, необходимо сохранить лимфоциты.

Для сохранения лимфоцитов в теплое время года пробирки помещают в лед.

С помощью иммунологических исследований определяется иммунологический статус при следующих инфекциях:

ВИЧ – инфекция;

Вирусные гепатиты;

Описторхоз;

Герпесные инфекции;

Коревая инфекция;

Грибковые заболевания;

Хломедиаз:

Иммунологические исследования очень сложные в своём проведении и дорогостоящие. Чаще применяется Реакция иммунноферментивного анализа (РИФА) и иммуноблотинга.

Реакция иммунноферментивного анализа (РИФА).

РИФА основана на соединенных иммунных белков с ферментами токсинов возбудителей и применяется в крупных ЛПУ и НИИ.

Реакция иммуноблотинга.

Также как и реакция РИФА применяется в основном для диагностики вирусных инфекций в крупных ЛПУ и НИИ.

Аллергические методы.

Аллергические методы лабораторной диагностики основаны на выявлении гиперсенсибилизации организма к определенным токсинам отдельных микроорганизмов при введении в организм небольших доз специфических аллергенов. Аллерген вводится в небольших количествах накожно и внутрикожно и очень редко на слизистую оболочку глаза.

При наличии специфической аллергической реакции через некоторое время в месте введения появляется специфическое аллергическое воспаление в виде гиперемии с инфильтрацией. Реакция считается положительной, если участок воспаления через 24-48 часов более 1 сантиметра в диаметре. Чаще этот метод лабораторной диагностики применяют для диагностики туберкулёза, токсоплазмоза, бруцеллеза, туляремии, орнитоза и сибирской язвы.

 

 

Биохимические методы исследования.

Биохимический анализ крови широко используется для диагностики многих заболеваний. Кровь на исследование берется из вены строго натощак. При нарушении этого условия, отмечаются искажения основных показателей, и такой результат становится не информативным, а также может спровоцировать на заведомо ложный диагноз.

В биохимическом анализе крови определяют следующие показатели: уровень глюкозы, белки (общий белок, гамма-глобулины, альфа-2-глобулины, альфа-глобулины, бета-глобулины, альфа-фетопротеин С-реактивный белок), мочевая кислота, бета-липопротеиды, холестерин, триглицериды, ферменты крови (амилаза, АЛТ, АСТ и другие) билирубин и т.д.

Основные правила сдачи крови для биохимического исследования:

1. Перед сдачей необходимо ограничить себя в курении (курение повышает количество эритроцитов и уровень глюкозы в крови);

2. Перед сдачей не употреблять алкогольные напитки (алкоголь увеличивает содержание мочевой кислоты и снижает уровень сахара в крови);

3. Перед сдачей уменьшить употребление кофе и крепкого чая (повышают количество лейкоцитов и эритроцитов, а также сахар крови);

4. Перед сдачей исключить физические нагрузки и напряжение (повышается содержание сахара);

5. Перед сдачей крови в течение 2 суток необходимо воздержатся от употребления жирной, жареной, острой и копченой пищи (способствуют повышению в крови калия, щелочной фосфатазы и триглицеридов).

6. Перед сдачей нежелательно голодать (голодание более 48 часов, приводит к увеличению содержания билирубина в крови, а свыше 72 часов способствует снижению сахара в крови до нижней границы нормы и одновременно повышается содержание мочевины и свободных жирных кислот);

7. Кровь не следует сдавать при приеме лекарств, и после проведения рентгенографии, физиотерапевтических процедур и других исследований.

7. Кровь на исследование нужно сдавать натощак (последний прием пищи не менее чем за 10 часов до взятия крови).

9. Перед проведением процедуры следует отдохнуть 10-15 минут и успокоиться.

10. Забор крови, на биохимическое исследование, должна проводить медицинская сестра процедурного кабинета в стерильных условиях и стерильным материалом. При необходимости забор может провести постовая сестра или лаборант с соблюдением всех мер инфекционной безопасности.

Требования к пробиркам.

Пробирки должны быть чистыми и сухими и храниться при комнатной температуре. Иглы должны иметь большой диаметр (чтобы не разрушить эритроциты). Гемолиз наступает при быстром заборе, при заборе при низких температурах и при длительной фиксации жгута на конечности. В некоторых пробирках может находиться реактив.

Далее пробирка с кровью и направлением в специальном контейнере передается в клинико-биохимическую лабораторию диагностического центра для проведения исследования.