Полимеразная цепная реакция.

Полимеразная цепная реакция является совершенно новым видом прямой диагностики заболеваний. ПЦР была открыта в первой половине 20 века американским ученым биохимиком (За ПЦР в дальнейшем он получил Нобелевскую премию)

Суть реакции заключается в том, что берется любой биологический материал

и с помощью компьютерных технологий в нем отыскивают обломки (геномы) ДНК или РНК микроорганизмом. Этот метод позволяет выявить возбудителя в исследуемом материале без выделения его в питательной культуре, но, к сожалению, он применяется редко, т.к. дорогостоящ и сложен по проведению, требует специального диагностического оборудования подготовки персонала

 

Косвенные методы лабораторной диагностики.

 

Выделяют две группы косвенных методов лабораторной диагностики инфекции, с помощью которых по косвенным признакам находят возбудителей инфекционных болезней:

Сывороточные методы

Аллергические методы

Серологические методы.

Серологическими называют такие методы (реакции) для которых используется сыворотка крови больного содержащая антитела или токсины микроорганизмов и специальные диагностики, в которых содержатся токсины известных микроорганизмов или уже известные иммуноглобулины

Впервые серологические методы лабораторной диагностики были предложены в 1886 году французом Видалем для диагностики брюшного тифа.(РА) Эта реакция была основана на обнаружении специфических О и Н антител в сыворотке крови больного брюшным тифом

При длительно текущих болезнях для более достоверного получения данных применяют метод «парных сывороток», то есть одну и ту же реакцию проводят дважды и сравнивают полученные результаты.

В настоящий момент применяют более чувствительные методы серологического исследования, позволяющие обнаружить в крови антител в 10 раз меньше содержания. Эти реакции дают положительный результат в 82%.

Важнейшее место в диагностике занимает иммуннофлюоресцентный метод. Этот метод позволяет выявить возбудителя в исследуемом материале без выделения его в питательной культуре, но, к сожалению, он применяется редко, т.к. дорогостоящ и сложен по проведению.

Окончательный диагноз ставится только на основании бактериологических и серологических исследований и ПЦР.

С помощью серологических реакций идентифицируются микроорганизмы, токсины, а природу антитела в крови больного определяют с помощью известного диагностического антигена.

Основными серологическими реакциями являются:

1. Реакция агглютинации;

2. Реакция преципитации;

3. Реакция связывания комплемента;

4. Реакция иммунофлооресценции;

5. Реакции лизиса;

6. Реакция нейтрализации вирусов на культуре клеток;

7. Реакция торможения гемагглютинации;

8. Реакция иммуноферментативного анализа;

9. Реакция

Общие закономерности серологических реакций:

1. Реакции ставят вне организма человека

2.Реакции проявляются при иммунологическом соответствии

антигена и антитело в соответствующих оптимальных условиях температуры и кислотности среды

Иммунные диагностические сыворотки получают от крупных животных, путем многократного заражения или введения токсинов.

К диагностическим сывороткам относятся:

1. Агглютинирующие бактерии;

2. Прецепитирующие бактерии;

3. Гемолизирующие бактерии;

4. Антивирусные сыворотки;

5. Антитоксические сыворотки;

6. Люминесцентные сыворотки;

7. Флюорохромные сыворотки;

К диагностическим антигенам относятся взвеси животных и убитых микроорганизмов и их токсины.

Серологическая идентификация микробов

Серологическая идентификация микробов основана на их антигенной структуре. Для проведения лабораторного исследования применяют специфические иммунные сыворотки, полученные искусственным путем.

Сыворотки позволяют установить родовую, видовую и типовую принадлежность микроба. В основе реакции лежит специфическое взаимодействие антигена с антителом. Могут бить использованы реакции агглютинации, преципитации и лизиса.

 

Виды сывороточных реакций

Реакции агглютинации (склеивания)

Агглютинацией называю склеивание бактерий при действии на них специфических антител в присутствии электролита. Её применяют для определения вида отдельных бактерий в сыворотке крови больного.

В качестве диагностикума применяют монорецепторную, типоспецифическую, абсорбированную сыворотку. Реакции ставят на покровном стекле.

Типы реакций агглютинации.

А) Ориентировочная реакции агглютинации.

Эту реакцию применяют для того, чтобы отобрать из общей группы не агглютинирующиеся колонии. При агглютинации образуются хлопья, а если она отсутствуют, и реакции нет, то жидкость остается равномерно мутной.

Б) Развернутая реакция агглютинации.

Эту реакцию проводят для идентификации бактерий в нескольких пробирках, в которых находятся двукратно разведенные диагностические сыворотки (1:100,1:200.1:400 т.д.) в которые добавляют по 1-2 капли взвеси бактерий. Реакцию читают через 18-20 часов выдерживания в термостате.

Интенсивность реакции выражается в «+».

В) Реакция агглютинации для серологической диагностики инфекций. (РА)

При использовании реакции агглютинации (РА) для выявления в сыворотке больных антител к соответствующему патогенному микроорганизму берут 5 мл. крови пациента, получают сыворотку, разводят в изотоническом растворе от 1:50 до 1:1600 так как в концентрированном растворе могут быть нормальные антигены у здоровых людей или больных со схожими болезнями и выдерживают в термостате в течении 20 минут для инактивации посторонних белковых примесей.

В качестве антигена используют взвесь известных убитых микроорганизмов (диагностикум) с которыми безопасно работать. Реакцию ставят, как и развернутую реакции агглютинации в пробирках.

Диагностическое значение имеют разведения титра 1:200-1:400 и более. Чем больше разведение, тем реакция более достоверна. Обычно используют, метод парных сывороток, – проводя, идентичную реакцию спустя 5-7 дней и сравнивают, полученные результаты. Титр агглютинации должен повышаться и реакция должна происходить в больших разведениях, чем предыдущая, т.к. происходит накопление антител.

Г) Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Ставится для обнаружения в сыворотки крови больного полисахаридов, белков, экстрактов бактерий, микоплазм, риккетсий, и вирусов и антигенные комплексы которых с иммуноглобулинами при классической реакции агглютинации увидеть не удается.

Для РНГА готовят в научно исследовательских институтах (НИИ) эритроцитарные антигенные диагностикумы. Для этого на эритроциты барана, после предварительной их обработки, искусственно насаждают антигены. Для проведения реакций используют специальные луночковые пластмассовые пеналы. Сыворотку больного разводят от 1:10 до 1:1280 и далее разливают по луночкам, туда же добавляют по 0,25 мл диагностикума. Результаты читают через 2 часа и оценивают в +.

а) ++++ эритроциты равномерно покрывают всю лунку в виде зонтика.

б) +++ эритроциты в виде зонтика, в центре небольшое кольцо из нескольких эритроцитов.

в) + + то же самое, но не связанных эритроцитов больше.

г) + преобладают в основном не склеенные эритроциты.

д) - сплошные не склеенные эритроциты в виде диска, или пуговицы.

Реакции преципитации.

Реакцией преципитации (РП), называют осаждение из раствора антигена при воздействии на него иммунной сывороткой, и эритроцитами. С помощью Р.П. можно выявить антиген в разведении 1:100000 и более.

Преципитиногены представляют собой очень мелкие частицы белково-полисахаридной природы, очень термоустойчивые и поэтому их поучают кипячением.

Для реакции преципитации используют жидкие прозрачные антигены. Преципитирующие сыворотки обычно получают гипериммунизацией кроликов.

Типы реакции преципитации.

А) Реакция Асколя

В узкую пробирку осторожно наливает 0,5 мл сыворотки, а затем пипеткой осторожно, по стенке наливают 0,5 мл антигена. При положительной реакции через 5-10 минут на границе между двумя средами появляется диагностическое кольцо.

Эту реакцию применяют для диагностики сибирской язвы, туляремии и чумы.

Б) Реакция Оухтерлони.

Реакцию ставят на чашки Петри в луночках агарового геля (хорошо отмытым I % агар). Луночки делают на некотором расстоянии друг от друга. Антигена и сыворотки наливает в луночки отдельно. Реакцию читают через 24 -48 часов. При положительной реакции наблюдается движение антигена и антитела навстречу друг другу, при соединении они образуют комплекс в виде белой полосы. Широко применяют для диагностики болезней, возбудители которых образуют экзотоксин (дифтерия и т.д.).