Работа № 3. Определение активности фруктозо-1-фосфаталь-долазы.

Принцип метода основан на связывании фосфотриоз, образующихся после расщепления ферментом фруктозо-1-фосфата, гидразином, с последующим определением триоз, освобождающихся при щелочном гидролизе продуктов динитрофенилгидразиновой реакции.

Ход работы. В пробирку внести 1 мл сыворотки крови и 0,5 мл субстратного раствора (100 мл бариевой соли фруктозо-1-фосфата растворить в 180 мл дистиллированной воды, прибавить 82 мл гидразин-гидрохлорида и довести рН до 7,4, добавляя 0,75н. NаОН, прилить веронал-мединаловой буфер рН 7,4 до конечного объема 400 мл).

В контрольную пробирку внести 1 мл сыворотки крови. Инкубировать в термостате контрольную и опытную пробу 30 мин при 37°С. После инкубации в контрольную пробирку добавить 0,5 мл субстратного раствора. Остальные реактивы приливать в обе пробирки одновременно. Для дефосфорилирования образовавшейся фосфотриозы прибавить по 1 мл 0,75 н NаОН и оставить при комнатной температуре на 30 мин. Добавить по 0,5 мл 2,4-динитрофенилгидразина 0,1 % раствора в 2 н НСI (500 мл 2,4-ДНФГ растворяют в 80 мл концентрированной НСI при слабом нагревании и доводят до 500 мл водой) и оставить на 30 мин. Затем добавить по 3 мл 0,75 н NаОН и через 5 минут опытную пробу колориметрировать на ФЭКе при зеленом светофильтре против контроля.

Расчет. Количество образовавшихся триоз определить по стандартной кривой, построенной по диоксиацетону. Активность фермента рассчитать по формуле А=а/Т, где А – активность фермента (мкмоль) в 1 мл сыворотки за 1 мин; а – количество образовавшихся триоз, рассчитанное по стандартной калибровочной кривой; Т – время инкубации (мин).

Клинико-диагностическое значение. Активность альдолазы в сыворотке крови увеличивается при инфекционном гепатите, токсических поражениях печени и некоторых других заболеваниях.

Работа №4. Количественное определение активности каталазы крови методом А.Н. Баха и С.Р. Зубковой.

Принцип метода. Метод основан на титровании избытка перекиси водорода, нерасщепленного каталазой, перманганатом калия в кислой среде.

5Н₂О₂ + 2КМnО₄ + 3Н₂SО₄ → 8Н₂О + 5О₂ + К₂SО₄ + 2MnSО₄

Активность каталазы выражается каталазным числом, которое представляет собой количество перекиси водорода в миллиграммах, разложенной 1 мл³ крови за 30 минут. Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1 мкл исследуемой крови.

Ход работы. С помощью микропипетки берут кровь из пальца человека или хвоста/уха экспериментального животного и готовят гемолизат крови, разводя ее в 1000 раз в мерной колбе (0,1 мл в 100 мл дистиллированной воды).

В 2 колбочки или широкие пробирки отмерить по 7 мл дистиллированной воды и по 2 мл 1% раствора пероксида водорода. В опытную колбу/пробирку прилить 1 мл разведенной в 1000 раз крови. Обе колбы/пробирки – опытную и контрольную – оставить на 30 минут при комнатной температуре. По истечении указанного времени в обе пробы добавить по 3 мл 10 % раствора серной кислоты, которая прекращает действие каталазы. Содержимое опытной и контрольной проб оттитровать 0,1 н раствором перманганата калия до слабо-розового цвета.

Расчет. Допустим, что на титрование опытной пробы пошло 4,5 мл 0,1 н раствора КМnО₄, а контрольной – 12,6 мл 0,1 н раствора КМnО₄. 0,1 н раствора КМnО₄ соответствует 1 мл 0,1 н Н₂О₂, а 1 мл Н₂О₂ соответствует 1,7 мг Н₂О₂. Следовательно, в данном случае каталазное число соответствует: (12,6 – 4,5) × 1,7 = 13,77 единиц.

Показатели нормы. Каталазное число крови у людей колеблется в пределах от 11 до 20 единиц. В клинике чаще используется показатель каталазы, который в норме составляет 2-3×10^-6.

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм кофеина, ацетоновых тел, алкоголя. Активность каталазы в крови снижается при ряде заболеваний: раке, анемии, туберкулезе и др.