Работа № 3. Выделение казеиногена из молока.

В молоке казеиноген содержится в виде растворимой кальциевой соли. При подкислении достигается изоэлектрическая точка, и казеиноген выпадает в осадок в свободном виде. Избыток кислоты мешает осаждению, т.к. при pH ниже изоэлектрической точки (pH=4,7) молекулы белка перезаряжаются, и казеиноген вновь переходит в раствор.

Ход работы. Молоко (2 мл) разбавляют равным объемом дистиллированной воды и осаждают казеиноген добавлением 2 капель 10% раствора уксусной кислоты. Казеин выделяется в виде хлопьевидного осадка, который отфильтровывают и промывают на фильтре дистиллированной водой (2-3 раза). Небольшие порции осадка снимают с фильтра стеклянной палочкой и употребляют для цветных реакций на белки (провести биуретовую пробу).

 

Работа № 4. Гидролиз казеина и открытие в гидролизате фосфорной кислоты.

Ход работы. 100 мг порошка казеина растворяют в пробирке в 3 мл 10% раствора едкого натра или кали. Пробирку закрывают пробкой со стеклянной трубкой в качестве холодильника, закрепляют ее на асбестовой сетке металлической лапкой и нагревают. Через час после начала кипения жидкости гидролиз прекращают, жидкости дают остыть и нейтрализуют ее концентрированной азотной кислотой (12-15 капель) до слабокислой реакции на лакмус. При нейтрализации выпадает осадок высокомолекулярных продуктов неполного гидролиза белков (пептоны). После отстаивания жидкость фильтруют, с фильтром проделывают молибденовую пробу на фосфорную кислоту (к 20 каплям молибденового реактива добавляют 2-3 капли гидролизата и кипятят несколько минут на голом огне). Выпадает небольшой кристаллический осадок фосфорномолибденовокислого аммония (лимонно-желтого цвета).

12(NH₄)₂·Mo O₄ + H₃PO₄ + 21HNO₃ → (NH₄)₃PO₄·12Mo O₃ + 21 NH₄NO₃ + 12 H₂O

желтый кристаллический осадок

 

По результатам проведенных качественных проб на простетические группы сложных белков заполните следующую таблицу:

Сложный белок	Простетическая группа	Реакция, характерная для простетической группы	Результат	Чем обусловлена реакция

Работа № 5. Определение липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в сыворотке крови турбидиметрическим методом.

Клинико-диагностическое значение. Содержание ЛПНП (b-липопротеинов) в крови колеблется в зависимости от возраста, пола и составляет в норме 3-4,5 г/л. Увеличение концентрации ЛПНП наблюдается при атеросклерозе, механической желтухе, острых гепатитах, хронических заболеваниях печени, сахарном диабете, гликогенозах, ксантоматозе и ожирении.

Принцип метода. Метод основан на способности ЛПНП образовывать с гепарином комплекс, который под действием хлорида кальция выпадает в осадок. По степени помутнения раствора судят о концентрации ЛПНП в сыворотке крови.

Ход работы. 1. В пробирку вносят 2 мл раствора хлорида кальция и 0,2 мл сыворотки крови. Содержимое пробирки перемешивают.

2. Определяют оптическую плотность раствора (Е₁) против раствора хлорида кальция при красном светофильтре (630нм) в кювете на 0,5 см.

3. Раствор из кюветы переливают в пробирку, добавляют микропипеткой 0,04 мл 1% раствора гепарина и точно через 4 мин снова определяют оптическую плотность раствора (Е₂) в тех же условиях.

4. Рассчитывают концентрацию ЛПНП (с, г/л) по стандартной формуле:

С = (Е₂- Е₁) х 10, где 10 – эмпирический коэффициент

Эталоны ответов к тестовым заданиям

Вид 1. 1.1. –в; 1.2. – б; 1.3. –д;

Вид 2. 2.1. – 1-б, 2-г, 3-в, 4-а;

2.2. - 1-а, в; 2-е; 3-б; 4-г, д; 5-ж, в;

2.3. 1-б, д, в; 2-б; 3-а; 4-д, в; 5-е; 6-г;

Вид 3. 3.1. – 2,4,5; 3.2. – 1,3;

Вид 4. 4.1. –А (+, +, +); 4.2.– С (+, -, -).

 

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1. Метгемоглобинемия, спровоцированная длительным приемом нитратов.

Задача 2. Содержание урогликопротеидов в моче снижено. Наличие крови и белка в моче может указывать на воспалительный процесс в мочевыводящих путях или о мочекаменной болезни. Необходимо определить содержание мочевой кислоты в моче.