Занятие № 2. Физико-химические свойства белков.

Цель занятия. Изучить физико-химические свойства белков и овладеть некоторыми методами их анализа, используемыми в диагностических и препаративных целях.

Студент должен
знать:	уметь:
-строение белковой молекулы – уровни организации и связи их стабилизирующие; -электрические, амфотерные свойства белков; -факторы, определяющие растворимость белков; -методы осаждения белков из растворов.	-разделять альбумины и глобулины крови методом высаливания; -определять количественное содержание белка в моче методом Брандберга-Роберта-Стольникова; -интерпретировать полученные данные.

Содержание занятия. После контроля выполнения самоподготовки студентам предстоит ответить на вопросы тест-контроля и вопросы преподавателя, провести фракционирование белков сыворотки крови методом высаливания, осаждение белков под действием температуры, органических и минеральных кислот, солей тяжелых металлов и количественное определение содержание белка в моче по методу Брандберга-Робертса-Стольникова, проанализировать полученные результаты и сделать соответствующие выводы.

УИРС. Решение ситуационных задач и обсуждение реферативных сообщений. Качественное и количественное исследование мочи на содержание белка. Сравнение различных методов количественного определения белка моче.

Методические указания к самоподготовке

При подготовке к занятию следует повторить структуры белка, вспомнить типы связей, стабилизирующие первичную, вторичную и третичную структуры белков. Необходимо изучить обратимые и необратимые методы осаждения белков, их амфотерные и электрические свойства. Для успешного усвоения материала при подготовке к занятию, пользуясь учебником и лекциями и по биохимии, дополнительной литературой, выполните следующие задания.

№№	Задание	Указания к выполнению задания
1.	Изучите биологическую роль белка.	1. Выпишите основные биологические функции, которые выполняют белки в организме человека и животных.
2.	Вспомните современные представления о структуре белка.	1. Напишите схематически типы химических и физических связей, участвующих в образовании белковой молекулы. 2. Охарактеризуйте, какие связи участвуют в образовании первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры белка. 3. Что такое фолдинг белка? Роль шаперонов, белков теплового шока в формировании и поддержании нативной конформации белков, дайте понятие о прионовых болезнях.
3.	Изучите растворимость и осаждаемость белков.	1. Перечислите факторы, определяющие растворимость белков. 2. Охарактеризуйте особенности белковых растворов. В чем суть нефелометрического определения содержания белка? 3. Приведите два основных фактора стабилизации белка в растворе. 4. В чем суть явления высаливания? 5. Приведите примеры практического использования высаливания. 6. Дайте определение явлению денатурации. Приведите классификацию видов денатурации. 7. Объясните механизм денатурирующего действия температуры, солей тяжелых металлов, спиртов, фенолов. 8. Приведите примеры практического использования денатурации белков.
4.	Изучите электрические свойства белков.	1. Докажите амфотерные свойства белков. 2. Напишите схему диссоциации карбоксильной группы и аминогруппы в составе белка. 3. Выпишите два основных фактора, определяющих заряд белковой молекулы. 4. Напишите, что называется изоэлектрической точкой. Каковы свойства белков в изоэлектрическом состоянии?

Выпишите кратко принцип метода и технику работ, выполняемых на лабораторном занятии. При этом не забывайте оставлять места для выводов и расчётов.

 

Графологическая структура «Методы осаждения белка»

Примеры тестов контроля исходного уровня знаний

Вид 1. Выберите один наиболее правильный ответ.

1.1. А. Изоэлектрическая точка пептида гли – ала – вал находится в … зоне рН.

а) нейтральной

б) слабокислой

в) щелочной

 

1.1. Б. В щелочной среде (рН 10) данный пептид будет двигаться к …

а) аноду

б) катоду

 

1.2. … прерывает a-спирализацию полипептидной цепи.

а) тирозин б) триптофан в) валин г) пролин д) аспарагин

 

1.3. На поверхности глобулярного белка, растворимого в воде, наименее вероятно расположение аминокислотных остатков ….

а) арг, глу б) лиз, асп в) вал, лей

 

1.4. Рассчитайте значение рI дипептида лиз-асп, если рI аспартата составляет 2,97, а рI лизина – 9,74.

а) 6,36 б) 4,24 в) 12,71

 

Вид 2. Установите соответствие.

2.1. Процессы, приводящие к осаждению белка при действии различных денатурирующих агентов.

1. сильные кислоты и щелочи а. водородные и ионные связи.

2. органические растворители б. гидрофобные взаимодействия

3. детергенты в. гидрофобные и ионные взаимодействия

4. восстанавливающие агенты г. дисульфидные мостики

5. тяжелые металлы д. гидрофобные взаимодействия и водор. св.

6. изменения температуры е. ионные связи и сульфгидрильные группы

7. мочевина ж. водородные связи

 

2.2. Уровень организации белковой молекулы – ее структурный элемент.

1. первичная структура а. домен

2. четвертичная структура б. виток спирали

3. вторичная структура в. протомер

4. третичная структура г. последовательность аминокислот

 

Вид 3. Правильное сочетание ответов

3.1. Накапливающийся в ткани мозга при болезни Альцгеймера β-амилоид представляет собой ….

1. продукт экспрессии мутантного гена

2.нормальный белок с измененной конформацией

3. глобулярный белок с высоким содержанием α-структур

4. нерастворимые фибриллы с β-складчатой структурой

 

3.2. Наиболее оптимальный метод осаждения белка с целью дальнейшего использования его биологической активности - это ….

1. осаждение органическими кислотами

2. осаждение гуанидинхлоридом

3. осаждение солями тяжелых металлов

4. высаливание

5. обработка парахлормеркурибензоатом или йодацетатом

 

3.3. При разделении белков сыворотки крови методом высаливания очистить их от сернокислого аммония позволяет ….

1. хроматография

2. спектроскопия

3. высушивание при 100⁰С

4. диализ

5. рефрактометрия

 

3.4. Прионовые белки ….

1. способствуют поддержанию нативной конформации белка

2. нарушают нативную конформацию белка, приводя к образованию функционально неактивных агрегатов

3. легко гидролизуются протеолитическими ферментами

4. устойчивы к действию протеаз

5. участвуют в фолдинге белков

 

Вид 4. Установите правильность утверждений и связь между ними.

4.1. Сернокислый аммоний вызывает денатурацию белка, потому что сернокислый аммоний обладает водоотнимающим действием.

 

4.2. Белки наиболее подвижны в электрическом поле в изоэлектрическом состоянии, потому что при этом белки имеют положительный заряд.

 

4.3. По значению изоэлектрической точки (ИЭТ) белка можно сделать некоторые выводы о его аминокислотном составе, поскольку при рН, соответствующем его ИЭТ, белок обладает наибольшей растворимостью.

Примеры ситуационных задач

Задача 1. Сделайте предположение об аминокислотном составе впервые выделенного пептида, принимая во внимание следующие экспериментальные данные:

-пептид не обладает электрофоретической подвижностью в щелочной среде (рН 9,8);

-при электрофорезе в кислой среде (рН 5,6) движется к катоду;

-не дает окрашивания при обработке концентрированной азотной кислотой (ксантопротеиновая проба отрицательна).

 

Задача 2. Многие патологические состояния могут сопровождаться изменением рН мочи. Например, для цистита характерна щелочная реакция мочи. Объясните, почему при анализе мочи на содержание белка, в частности при осаждении белков кипячением, необходимо контролировать рН и, если необходимо, доводить его до слабокислой реакции?

Задача 3. Белок, синтезируемый in vivo, принимает биологически активную конформацию. В то же время, при синтезе белка in vitro не всегда удается получить функционально активный белок, даже при отсутствии сбоев, ошибок в первичной структуре. Объясните этот феномен.

Самостоятельная работа студентов