Занятие № 3. Методы выделения и очистки белков.

Цель занятия. Освоить некоторые методы выделения и очистки белков, используемые в препаративной биохимии и лабораторной медицине. В результате освоения темы студент должен ознакомиться с методом электрофоретического разделения белков и научиться анализировать протеинограмму.

 

Студент должен
знать:	уметь:
-физико-химические свойства белков; -методы фракционирования белков; -методы очистки белков от низкомолеклярных примесей.	-анализировать протеинограмму; -производить очистку белка от низкомолекулярных примесей методом гель-фильтрации и диализа.

 

Содержание занятия: студентам предстоит ответить на вопросы тест-контроля и вопросы преподавателя; ознакомиться с методами электрофореза белка на бумаге, очистки раствора белка от низкомолекулярных примесей методом диализа и гельфильтрации на молселекте, проанализировать полученные данные и сделать выводы.

УИРС - решение ситуационных задач, обсуждение рефератов.

Методические указания к самоподготовке

Методы препаративной химии белков основаны на их физико-химических свойствах, поэтому при подготовке к занятию следует повторить физико-химические свойства белков. Особое внимание следует уделить коллоидным свойствам белков, таким понятиям как амфотерность аминокислот и белков, зависимость электрических свойств белков от аминокислотного состава и свойствам белков в изоэлектрическом состоянии. Для лучшего усвоения материала занятия, используя учебник, лекции и дополнительную литературу, выполните следующие задания.

 

№№	Задание	Указания к выполнению задания
1.	Изучите методы выделения индивидуальных белков.	1. Перечислите методы фракционирования белков, позволяющие получить индивидуальный белок. 2. Кратко сформулируйте, на каких физико-химических свойствах основаны перечисленные методы.
2.	Изучите, почему белки обладают свойствами коллоидов.	1.Выпишите способы определения молекулярной массы белков. 2.Перечислите данные, подтверждающие высокую молекулярную массу белков. 3.Чем можете подтвердить способность белков образовывать коллоидные растворы? 5.Охарактеризуйте принцип метода диализа. Какое практическое значение имеет диализ?
3.	Вспомните электрические свойства белков.	1. Вспомните механизм возникновения электрического заряда. Что такое изоэлектрическая точка? 2.Охарактеризуйте явление электрофореза белков. Запомните виды электрофореза. 3.Укажите факторы, от которых зависит скорость перемещения белковых молекул в поле постоянного электрического тока. 4. Напишите, на какие фракции разделяют белки сыворотки крови при электрофорезе на бумаге. Выпишите протеинограмму – соотношение белковых фракций - здорового ребенка и взрослого человека. 5. Изучите возможности электрофоретического разделения белков на полиакриламидном геле, принцип диск-электрофореза и его значение для разделения белков сыворотки крови.
4.	Повторите растворимость белков.	1. Выясните, чем определяется растворимость белков, и какие факторы стабилизируют белковую молекулу в растворе.
5.	Изучите метод хроматографии белков.	1.Выпишите классификацию методов хроматографического разделения белков по механизму разделения и технике проведения. Сформулируйте принцип метода адсорбционной, ионнообменной, афинной, и распределительной хроматографии. Кратко опишите процедуру гель-фильтрации и газожидкостной хроматографии.

 

Подготовьте к предстоящему занятию протокол, в котором отразите принцип метода и ход работы. Не забудьте оставить достаточно места для выводов после выполнения каждой работы.

Графологическая структура «Выделение и очистка белков»

Примеры тестов контроля исходного уровня знаний

Вид 1. Выберите наиболее правильный ответ.

1.1. Молекулярная масса большинства белков находится в пределах ….

а) от 6000 до 10000000 и выше

в) свыше 50000

б) от 30000 и выше

г) свыше100000

 

1.2. Глутаминовая кислота при рН 10 находится в виде иона ….

в)

б) г)

 

1.3. Смесь аминокислот, содержащая аспартат (pI 3,0) и лизин (рI 9,7), разделяется методом ионообменной хроматографии. В каком порядке будут выходить аминокислоты из колонки, заполненной триметиламинополистерольной смолой, имеющей положительно заряженные группы (анионообменник) при рН 7?

а) асп, лиз

б) лиз, асп

 

1.4. Детергенты (тритон Х-100, додецилсульфат натрия) при экстракции белков к среде извлечения добавляют для ….

а) повышения устойчивости белков к денатурации

б) перевода белков в изоэлектрическое состояние

в) разрушения белково-липидных комплексов

 

1.5.Оптическое явление, доказывающее коллоидные свойства белков,- это ….

а) явление светорассеивания – конус Тиндаля

б) вращение плоскости поляризованного света

в) интенсивное светопоглощение при длине волны 280 нм

 

Вид 2. Установите соответствие.

2.1. Классифицируйте приведенные ионообменные смолы в зависимости от заряда функциональных групп.

1. триметиламинополистирол а. катионообменник

2. диэтиламиноэтилцеллюлоза б. анионообменник

3. карбоксиметилцеллюлоза

4. сульфонированные полистиролы

 

2.2. В каком направлении будут двигаться в электрическом поле следующие белки при рН 6,3?

1. овальбумин (ИЭТ 4,6) а) останется на старте

2. β-лактоглобулин (ИЭТ 6,3) б) движется к катоду

3. химотрипсин (ИЭТ 9,5) в) движется к аноду

 

Вид 3. Правильное сочетание ответов.

3.1. Смесь аминокислот, содержащая:

1) глицин

2) аланин

3) лизин

4) глутаминовую кислоту

5) аргинин

подвергли электрофорезу на бумаге при pH=6.

Какие аминокислоты будут двигаться при этом условии к «аноду»?

 

3.2. Метод разделения белков, основанный на различии размера белковых молекул -

1. кристаллизация

2. диализ

3. ионообменная хроматография

4. гель-фильтрация

5. изоэлектрическое фокусирование

 

3.3. Электрофоретическая процедура, не зависящая от заряда белка -

1. диск-электрофорез

2. зональный электрофорез

3. изоэлектрическое фокусирование

4. электрофорез в полиакриламидном геле с добавлением детергента (натрия додецилсультата)

5. электрофорез на бумаге

 

Вид 4. Определите правильность утверждений и связь между ними.

4.1. Очистить раствор белка от низкомолекулярных примесей можно методом гель-фильтрации на сефадексе, потому что с помощью этого метода можно разделить вещества с разной молекулярной массой.

4.2. По степени дисперсности растворы белков являются истинными растворами, а по свойствам – коллоидными, так как белки являются высокомолекулярными соединениями.

 

Примеры ситуационных задач

Задача 1. При электрофорезе на бумаге белков сыворотки крови больного Р.С. получили следующие результаты: альбумины-48,5%, α₁-глобулины-12,6%, α₂-глобулины-7,3%, β-глобулины-14,8%, γ-глобулины-16,8%. Выделите изменения, обнаруженные в белковом спектре крови больного и рассчитайте величину белкового коэффициента, если общее содержание белка в крови у данного больного составляло 62 г/л.

Задача 2. Необходимо разделить смесь белков, содержащую церрулоплазмин (Mr 151000, ИЭТ 4,4), β-лактоглобуллин (молекулярная масса 150000, ИЭТ 6,3) и γ-глобулин (молекулярная масса 37100, ИЭТ 5,2). Предложите методы разделения смеси этих белков. В какой последовательности будут выделяться эти белки из смеси?

Самостоятельная работа студентов