Лабораторная работа: «Количественное определение белка биуретовым методом. Построение калибровочных кривых».

Определение концентрации белка проводят в научных учреждениях при изучении, выделении и очистке белков; в промышленности в процессе получения ферментов, пищевых белков, белковых лекарственных препаратов; в медицинских биохимических лабораториях для оценки состояния печени и почек.

Существует много разных методов количественного определения белков. Среди них широкое распространение получили колориметрические методы, основанные на способности белков давать окрашенные комплексы с рядом реактивов (цветные реакции). Среди этих методов наиболее распространены биуретовый метод и его модификация (метод Лоури[2]).

Цель работы

Освоить работу фотоэлектроколориметра (ФЭК). Научиться строить стандартные калибровочные кривые и определить содержание белка в растворе с неизвестной концентрацией.

Принцип метода

Биуретовый метод основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белка с ионами двухвалентной меди в щелочной среде (биуретовая реакция). Интенсивность развивающейся окраски раствора прямо пропорциональна концентрации белка и определяется фотометрически. Для количественного определения белка измеряют интенсивность окраски стандартных растворов белка с известной концентрацией (величину оптической плотности Dст). По полученным данным строят график зависимости оптической плотности окрашенных растворов от концентрации в них белка (стандартную калибровочную кривую). На оси ординат всегда откладывают величину D как функцию от задаваемых значений (см. рисунок).

Измеряют оптическую плотность Dх окрашенного раствора с неизвестной концентрацией белка и по стандартной кривой определяют в нем концентрацию белка. В качестве стандартного белка обычно используют раствор сывороточного альбумина.

Выполнение работы (см. приложение)

 

Реактивы, мл	Контроль	Стандартный белок 10 мг/мл	Стандартный белок 20 мг/мл	Стандартный белок 30 мг/мл	Неизвестный белок Х мг/мл
Раствор сывороточного альбумина	—	0,2	0,2	0,2	0,2
Н2О	0,2	—	—	—	—
Биуретовый реактив*
Перемешивают и инкубируют 30 минут при комнатной температуре
Фотометрируют против Н2О (l = 545 нм, толщина кюветы 1 см). D545
Dст - Dк

*Биуретовый реактив: исходный концентрат (медь сернокислая – 120 ммоль/л, калий иодистый – 300 ммоль/л, калий-натрий виннокислый – 320 ммоль/л, гидроксид натрия –3 моль/л) разводят перед работой 1:19

Оформление работы

 

 

В рабочей тетради записать и заполнить таблицу; построить стандартную кривую и определить по ней концентрацию белка в неизвестном растворе.

Выводы

Занятие 16.

Семинар по теме «Обмен белков и аминокислот»

Тестовые задания по теме: «Обмен аминокислот»

1. Вопросы, требующие однозначного ответа «да» (+) или «нет» (-).

1. Гистидин в печени способен дезаминироваться по внутримолекулярному типу.

2. Восстановленные коферменты оксидаз аминокислот могут непосредственно окисляться молекулярным кислородом.

3. Коферментом моноаминоксидаз (МАО) служит ФАД.

4. Декарбоксилирование аминокислот является необратимым процессом.

5. Аммиак образуется при любом типе дезаминирования аминокислот.

6. Обладает ли гистамин сосудосуживающим действием?

7. Является ли дофамин предшественником норадреналина?

8. Возможно ли декарбоксилирование 5-окситриптофана в организме человека?

9. Может ли из аланина образоваться глюкоза в организме человека и животных?

10. Относится ли лейцин к кетогенным аминокислотам?

 

Вопросы с выборочным ответом

 

Коферментом большинства декарбоксилаз аминокислот является: 1. ФАД 2. ФМН 3. ПФ 4. ТПФ 5. НАДФ

Декарбоксилирование аминокислот приводит к образованию: 1. спирта 2. альдегида 3. амина 4. амида 5. кетона

 

Тестовые задания по теме: «Пути обезвреживания аммиака в организме животных»

1. Вопросы, требующие однозначного ответа «да» (+) или «нет» (-).

1. Глутаминсинтетаза относятся к классу лигаз.

2. Образование карбамоилфосфата в синтезе мочевины требует затраты двух молекул АТФ.

3. Креатин в норме выводится с мочой.

4. Аргиназа катализирует образование оксида азота.

5. Аминогруппа аспартата служит одним из источников азота в молекуле мочевины.

6. Являются ли аминокислоты единственным источником аммиака в организме?

7. Может ли амидная группа глутамина включаться в молекулу мочевины?

8. Расходуется ли АТФ в глутаминсинтетазной реакции?

9. Участвует ли метионин в синтезе креатина?

10. Выводится ли ион аммония с мочой?

 

Вопросы с выборочным ответом

 

Аммиак в клетках мозга обезвреживается путем: 1. синтеза мочевины 2. образования солей аммония 3. превращения глутамата в глутамин 4. синтеза креатина 5. всеми перечисленными способами

Биосинтез мочевины происходит в: 1. почках 2. печени 3. надпочечниках 4. мочевом пузыре 5. поджелудочной железе

 

 

Тестовые задания по теме: «Особенности обмена отдельных аминокислот»

 

1. Вопросы, требующие однозначного ответа «да» (+) или «нет» (-).

1. Глицин участвует в синтезе пуриновых оснований.

2. В состав КоА входит β-аланин.

3. Аргинин служит источником образования оксида азота.

4. Монооксигеназы участвуют в образовании катехоламинов.

5. Серотонин образуется из серина.

6. Входит ли глутаминовая кислота в состав глутатиона?

7. Является ли гомогентизиновая кислота промежуточным продуктом превращения фенилаланина?

8. Возможно ли превращение гистидина в глутаминовую кислоту?

9. Является ли креатинфосфат макроэргическим соединением?

10. Возможны ли превращения глицина в серин и треонин?

Вопросы с выборочным ответом

 

Молекула глицина не участвует в синтезе: 1. гема 2. пуриновых оснований 3. пиримидиновых оснований 4. парных желчных кислот 5. креатина

Соединение, которое не образуется из тирозина: 1. гомогентизиновая кислота 2. адреналин 3. норадреналин 4. дофамин 5. фенилаланин

 

Занятие 17.