Руководство к практическим занятиям по биохимии

Руководство к практическим занятиям по биохимии

 

для студентов аграрного факультета

специальность «ветеринария»

 

 

 

Москва

 

 

УДК 577.1 ББК 28.072 Р 82

Утверждено РИС Учёного совета медицинского факультета Российского университета дружбы народов

 

Авторский коллектив:

 

И.П. Смирнова, Н.Н. Чернов, Т.А. Лобаева;

 

компьютерная верстка Т.А. Лобаевой

 

 

Р 82 Руководство к практическим занятиям по биохимии: Учебное пособие/ Под ред. И.П. Смирновой.- М.: Оргсервис-2000, 2008.- 101 с.

 

ISBN 5-98115-060-2

 

В сборнике представлены аудиторные (семинарские) и лабораторно-практические занятия, контрольные вопросы и тесты, составленные в соответствии с программой по биологической химии для студентов, обучающихся по специальности «ветеринария».

Учебное пособие может быть использовано студентами и преподавателями при проведении практических занятий, зачётов, экзаменов. Часть вопросов может быть использована для компьютерного контроля знаний студентов.

 

ISBN 5-98115-060-2

 

 

Объём 5,5 п.л. Тираж 100. Заказ…

Подписано в печать…………2008 г.

Формат 60х84/16. Бумага офсетная №1

Издательство «Оргсервис-2000»,

117419 ул. Орджоникидзе д.3

Типография «Оргсервис-2000».

 

© Коллектив авторов

Содержание

 

Введение
Список сокращений и условных обозначений
Общие правила техники безопасности в биохимической лаборатории
Календарный план лекций и лабораторных занятий по биохимии (специальность «ветеринария»)
Раздел 1. аминокислоты, Простые и сложные белки.
Занятие 1.
Занятие 2
Раздел 2. Нуклеиновые кислоты.
Занятие 3
Занятие 4
Раздел 3. Ферменты
Занятие 5
Занятие 6
Раздел 4. Витамины
Занятие 7
Занятие 8
Раздел 5. Гормоны
Занятие 9
Раздел 6. Обмен веществ и энегии. Химия и обмен углеводов.
Занятие 10
Занятие 11
Занятие 12
Раздел 7. Химия и обмен липидов.
Занятие 13
Занятие 14
Раздел 8. Обмен простых и сложных белков.
Занятие 15
Занятие 16
Занятие 17
Список литературы
Приложения

Введение

 

Перед вами по существу практикум по биохимии, представляющий собой единое по структуре занятий пособие, основная цель которого заключается в развитии у студентов творческого отношения к работе, критического анализа наблюдаемых явлений и фактов. Практические работы, которое имеет пособие, частично разработаны авторами, частично заимствованы из других источников, переработаны, упрощены и должны облегчить усвоение материала.

Руководство содержит материал всего курса практических занятий по биохимии для студентов, обучающихся по специальности «ветеринария», и включает:

1) план лекций и практических занятий

2) кратное теоретическое введение к соответствующей теме;

3) вопросы для внеаудиторной теоретической работы по разделу

4) методики выполнения лабораторных работ;

5) вопросы для текущего контроля, проводимого на каждом занятии;

6) примеры вопросов с выборочным ответом и вопросов на соответствие;

7) вопросы для самостоятельной подготовки студентов к коллоквиуму;

8) варианты письменных работ для коллоквиумов;

9) примеры заданий компьютерного тестирования (с ответами).

Ответы на вопросы компьютерного тестирования приводятся в конце каждого раздела. Предлагаемые вопросы для текущего контроля знаний студентов предназначены для самостоятельной подготовки по изучаемой теме, они легко воспринимаются на слух и могут быть использованы преподавателями для проверки знаний студентов. Результаты могут быть представлены в виде положительных или отрицательных ответов (+ и -) на специальных карточках, либо ответов «да» или «нет» при фронтальном опросе. Студенты учатся быстро на слух воспринимать вопросы, а преподаватель имеет возможность легко провести проверку и обсудить изучаемую тему.

Пособие подготовлено на кафедре биохимии медицинского факультета РУДН.

Авторы:

Смирнова Ирина Павловна – доктор биологических наук, профессор кафедры биологической химии;

Чернов Николай Николаевич – доктор биологических наук, профессор

кафедры биологической химии;

Лобаева Татьяна Александровна – кандидат биологических наук, доцент кафедры биологической химии.

Авторский коллектив заранее благодарен преподавателям и студентам за советы и замечания по содержанию представленного руководства. Ваши пожелания мы принимаем на кафедре биохимии медицинского факультета РУДН (ул. Миклухо-Маклая д.8), а также по электронной почте: [e-mail].

Желаем удачи в освоении новой дисциплины!

Список сокращений и условных обозначений

 

АДФ–аденозинтрифосфат АМК – аминокислота АМФ – аденозинмонофосфат цАМФ – циклический АМФ АТФ – аденозинтрифосфат АТФаза – аденозинтрифосфата ВЖК – высшая жирная кислота ГАФ – глицеральдегид-3-фосфат ГДФ – гуанозиндифосфат ГМФ – гуанозинмонофосфат ГТФ – гуанозинтрифосфат ДАГ – диацилглицеролы ДАФ – диоксиацетонфосфат НАДФН(Н^+)– α-КГ – α-кетоглутаровая кислота КоА – кофермент (коэнзим) А КоQ – кофермент (коэнзим) Q КФ – классификация ферментов ЛП – липопротеины ЛПВП – липопротеины высокой плотности ЛПНП – липопротеины низкой плотности ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности МАГ – моноацилглицеролы МАО – моноаминооксидаза НАД^+ – никотинамидадениндинуклеотид окисленный НАДН(Н^+) – никотинамидадениндинуклеотид восстановленный НАДФ^+ – никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановлен

ПВК – пировиноградная кислота ПФ – пиридоксальфосфат СДГ – сукцинатдегидрогеназа ТАГ – триацилглицеролы ТХУ – трихлоруксусная кислота УДФ – уридиндифосфат УМФ – уридинмонофосфат УТФ – уридинтрифосфат ФАД – флавинадениндинуклеотид окисленный ФАДН2 – флавинадениндинуклеотид восстановленный ФЕП – фосфоенолпируват ФМН – флавинаденинмононуклеотид Фн – неорганический фосфат ФФн – неорганический пирофосфат ФФК – фосфофруктокиназа ФЭК – фотоэлектроколориметр ХЭ - холинэстераза ЦТК – цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса) ЩУК – щавелевоуксусная кислота D – оптическая плотность Dоп – оптическая плотность опытного образца Dст – оптическая плотность стандартного образца Dк – оптическая плотность контрольного образца КМ – константа Михаэлиса Vmax – максимальная скорость реакции

План лекций

1-2 неделя. Строение живой клетки. Уровни структурной организации белка. Связь структуры белков с их биологическими функциями. Простые и сложные белки.

4 неделя. Ферменты. Строение ферментов. Природа активного центра. Аллостерическая регуляция. Изоферменты. Свойства ферментов, специфичность действия. Ингибиторы ферментов. Роль коферментов в реакциях обмена веществ. Применение ферментов.

. 6 неделя. Гормоны. Классификация гормонов. Механизмы действия гормонов. Примеры гормональной регуляции обмена веществ.

8 неделя. Введение в обмен веществ и энергии. Обмен углеводов. Распад и синтез гликогена в печени и мышцах. Анаэробный распад углеводов: гликолиз и гликогенолиз. Энергетический эффект. Глюконеогенез.

10 неделя. Аэробный обмен углеводов. Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты. Цикл Кребса, его энергетический эффект. Понятие о пентозофосфатном пути превращения углеводов. Регуляция углеводного обмена.

12 неделя. Обмен липидов. Классификация липидов. Значение микрофлоры рубца в переваривании липидов. Превращение глицерина и его роль.

β-окисление жирных кислот. Энергетический эффект распада пальмитиновой кислоты. Особенности распада жирных кислот у жвачных животных..

14 неделя. Роль ацетил-КоА в обмене липидов.Б иосинтез жирных кислот. Метаболизм кетоновых тел.«Кетозы».Роль холестерина в обмене веществ.

Обмен белков. Биологическая и кормовая ценность белков. Превращения

аминокислот в кишечнике, в тканях. Декарбоксилирование аминокислот.

16 неделя. Дезаминирование аминокислот. Пути обезвреживания аммиака. Орнитиновый цикл мочевинообразования. Обмен нуклеопротеинов. Распад пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов. Биосинтез пуриновых нуклеотидов.

18 неделя. Биосинтез пиримидиновых нуклеотидов. Особенности обмена белка у птиц. Патология азотистого обмена. Этапы биосинтеза белка.

Взаимосвязь обмена белков, жиров и углеводов.

 

 

Содержание практических работ

1-2 неделя. Семинар по теме: «Химия белков, аминокислоты». Цветные реакции на белки и аминокислоты.

 

3 неделя. Семинар по темам: «Нуклеиновые кислоты. Структура ДНК и РНК и их биологическая роль». Диализ белков.

 

4 неделя. Коллоквиум I по темам: «Простые белки, сложные белки, нуклеиновые кислоты». Контрольная работа.

 

5 неделя. Ферменты. Действия амилазы на крахмал.

 

6 неделя. Определение активности амилазы в моче крупного рогатого скота.

7 неделя. Витамины. Количественное определение витамина С в картофеле. Семинар по теме: «Витамины и коферменты».

 

8 неделя. Коллоквиум II по теме:«Ферменты и витамины». Контрольная работа.

9 неделя. Семинар по теме: «Биологическое окисление».

10 неделя. Определение продуктов ферментативного расщепления сахарозы и крахмала.

11 неделя. Семинар по теме: «Обмен углеводов», «Гормоны».

12 неделя. Коллоквиум III по темам: «Гормоны. Обмен углеводов». Контрольная работа.

13 неделя. Семинар по теме: «Обмен липидов. Роль холестерина в обмене. Регуляция липидного обмена». Кинетика действия липазы.

 

14 неделя. Расчет энергетического эффекта распада высших жирных кислот и глицерина. Определение ацетоновых тел.

 

15 неделя. Количественное определение белка. Контрольная работа.

16 неделя. Семинар по темам: «Обмен белков и аминокислот».

 

17 неделя. Коллоквиум IV по темам: «Обмен липидов и белков».

18 неделя. Контрольная работа. Итоговое занятие.

F Раздел 1 e

Занятие 1.

 

Вопросы с выборочным ответом

 

Положительным зарядом может обладать: 1. карбоксильная группа 2. аминогруппа 3. сульфгидрильная (тиольная) группа 4. спиртовая группа 5. амидная группа

К циклическим соединениям не относятся: 1. фенолы 2. пиримидины 3. стерины 4. триацилглицеролы 5. пурины

 

Занятие 2.

 

Вопросы с выборочным ответом

 

К неполярным (гидрофобным) аминокислотам относится: 1. глицин 2. треонин 3. лизин 4. валин 5. цистеин

Биуретовая реакция не дает окраски с: 1. простыми белками 2. дипептидами 3. трипептидами 4. альбуминами 5. желатиной

Аминокислота с незаряженным радикалом: 1. треонин 2. лизин 3. аргинин 4. гистидин 5. глутаминовая кислота

Для определения оптической плотности синего раствора используют светофильтр: 1. голубой 2. желтый 3. красный 4. зеленый 5. синий

Смесь различных белков невозможно разделить методом: 1. ионнообменной хроматографии 2. электрофореза 3. высаливания 4. диализа 5. гель-фильтрации

Шапероны участвуют в образовании: 1. первичной структуры белков 2. первичной структуры нуклеиновых кислот 3. третичной структуры нуклеиновых кислот 4. четвертичной структуры белков 5. вторичной структуры нуклеиновых кислот

 

Цель работы

Провести цветные реакции с двумя растворами (I и II)[1], один из которых содержит овальбумин (яичный белок), а другой – желатину (овальбумин содержит все 20 аминокислот, а желатина только 17), и определить, в каком растворе содержится овальбумин, а в каком – желатина.

Принцип метода

Ряд химических реактивов специфически взаимодействуют (реагируют) с функциональными группами аминокислот (как свободных, так и в составе пептидов или белков) в результате чего развивается специфическое окрашивание. Такие реакции называют цветными реакциями. Интенсивность окраски в цветных реакциях пропорциональна количеству реагирующих функциональных групп. Поэтому цветные реакции могут быть использованы для качественного и количественного определения белков, для определения присутствующих в них аминокислот или для анализа состава белков.

Так, например:

1) биуретовой реакцией определяют наличие пептидных групп в олигопептидах и в белках (универсальная для любых белков).

2) нингидриновой реакцией определяют наличие a-аминогрупп в свободных аминокислотах, а также в аминокислотах олигопептидов и белков (универсальная для любых белков).

3) ксантопротеиновой реакцией определяют наличие в белках ароматических аминокислот.

4) реакцией Фоля определяют наличие в составе белков серосодержащей аминокислоты – цистеина.

Студенты проводят указанные цветные реакции на 4-х предметных стеклах:

На один край каждого стекла наносят 1 каплю раствора I, на другой – раствора II

 

. Методики выполнения работы на предметных стёклах:

Биуретовая реакция. К белкам на первом стекле последовательно добавляют 1 каплю 10% NаOH и 1 каплю 1% CuSO₄, аккуратно перемешивая стеклянной палочкой.

Нингидриновая реакция. К белкам на втором стекле добавляют 1 каплю раствора нингидрина. Перемешивают. Осторожно нагревают до кипения.

Ксантопротеиновая реакция. К белкам на третьем стекле добавляют 1 каплю концентрированной HNO₃. Перемешивают. Осторожно нагревают.

Реакция Фоля. К белкам на четвертом стекле добавляют 1 каплю 30% NaOH и 1 каплю (CH₃OO)₂Pb. Нагревают до кипения.

Выводы

Заполнить таблицу, сравнить полученные окраски, определить, в каком растворе овальбумин, а в каком – желатина и обосновать этот выбор.

F Раздел 2 e

Занятие 3.

Вопросы с выборочным ответом

Фетальный гемоглобин содержит полипептидные цепи: 1. только альфа 2. только бета 3. альфа и бета 4. альфа и гамма 5. только гамма	Простетической группой гликопротеинов может быть: 1. галактоза 2. глюкозамин 3. глюкуроновая кислота 4. нейраминовая кислота 5. все вышеперечисленные соединения
Какие типы связей формируют первичную структуру нуклеиновых кислот? 1. ионные 2. гидрофобные 3. водородные 4. пептидные 5. сложноэфирные	Интерфероны - это молекулы: 1. простых белков и гликопротеинов 2. одноцепочечной РНК 3. двухцепочечной РНК 4. фосфопротеинов 5. гемопротеинов

 

3.2. Лабораторная работа: «Диализ белков».

 

Диализом называют процесс разделения высокомолекулярных веществ (например, белков) и низкомолекулярных (например, солей) с помощью полупроницаемых мембран.

Полупроницаемыми называют мембраны, диаметр пор которых позволяет проходить только низкомолекулярным соединениям. Примером естественных полупроницаемых мембран могут быть капсулы Боумена—Шумлянского почек. Широко используют искусственные полупроницаемые мембраны: целлофан, коллодий, на основе которых созданы диализаторы, в том числе «искусственная почка».

Метод диализа используют в научных лабораториях, в промышленности, в клинической практике.

Цель работы

Доказать, что низкомолекулярное соединение NaCl проходит через полупроницаемую мембрану, а высокомолекулярный белок не проходит и остается в диализируемом растворе.

Принцип метода

Метод основан на том, что низкомолекулярные вещества легко диффундируют через полупроницаемые мембраны в чистый растворитель, образуя диализат. Диффузия будет продолжаться, пока не произойдет выравнивание концентраций диффундируемого вещества между диализируемым раствором и диализатом. Процесс возобновится, если диализат заменить чистым растворителем или, если эта смена будет происходить постоянно (проточный диализ).

Выполнение работы

Подготовка диализатора: полупроницаемой мембраной могут быть диализные трубки или целлофановые диализные мешочки. Целлофан (квадрат 10х10 см) смачивают дистиллированной водой, делают в нем углубление и получают диализный мешочек.

Приготовление диализируемого раствора: в диализный мешочек помещают 20 капель разведенного яичного белка в 5 % растворе NaCl (белок одного яйца разводят в 300 мл 5% раствора NaCl) и перемешивают. Края целлофана зажимают между двумя стеклянными палочками, скрепленными между собой резиновыми кольцами.

Диализ. Мешочек с солевым раствором белка помещают в стакан с дистиллированной водой так, чтобы часть мешочка с раствором белка была полностью погружена в воду. Сразу же, на просвет можно заметить струйки солевого раствора, опускающиеся из мешочка на дно стакана, что обусловлено изменением рефракции воды.

Анализ результатов диализа. Через 60 мин после начала диализа проводят качественные пробы на белок (биуретовую реакцию) и на NaCl (с AgNO₃) в соответствии с таблицей.

 

Реактивы	Проба на белок в диализате	Проба на белок в диализируемой жидкости	Проба на ионы Cl^- в диализате
Диализат	10 капель	–	10 капель
Диализируемый раствор	–	10 капель	–
10 % NaOH	5 капель	5 капель	–
1 % CuSO4	1 капля	1 капля	–
10 % HNO3	–	–	1 капля
1 % AgNO3	–	–	1 капля
Наблюдения

Выводы

 

Занятие 4.

Варианты письменной части коллоквиума

Вариант 1.

1. Написать формулу трипептида: глутамилпролиллизин

2. Соединить в динуклеотид: ЦМФ и ГМФ

3. Какими методами можно разделить альбумины и глобулины?

4. Как можно определить наличие в растворе: трп?

Вариант 2.

1. Написать формулу трипептида: аспартиллизилпролин

2. Соединить в динуклеотид: дЦМФ и ТМФ

3. Какими методами можно разделить казеин и продукты его гидролиза?

4. Как можно определить наличие в растворе: мет?

Вариант 3.

1. Написать формулу трипептида: пролиларгинилглутамат

2. Соединить в динуклеотид: дАМФ и ТМФ

3. Какими методами можно разделить гис и гли?

4. Как можно определить наличие в растворе: глобулинов?

Вариант 4.

1. Написать формулу трипептида: гистидиллизилсерин

2. Соединить в динуклеотид: АМФ и ГМФ

3. Какими методами можно разделить асп и арг?

4. Как можно определить наличие в растворе: цис?

 

Варианты заданий на компьютерном тестировании

Инструкция к тесту: Выбрать все правильные ответы

1. Заменимая аминокислота для человека:

1. фенилаланин

2. тирозин

3. триптофан

4. треонин

5. метионин

2. Гидрофобная аминокислота:

1. глутамин

2. серин

3. треонин

4. фенилаланин

5. гистидин

3. При денатурации белка не нарушаются связи:

1. дисульфидные

2. водородные

3. пептидные

4. ионные

5. гидрофобные

4. Величина R_f при бумажной хроматографии будет наибольшей для амиинокислоты:

1. глицина

2. треонина

3. серина

4. глутамата

5. валина

 

5. Отрицательно заряженной АМК является:

1. глутамин

2. аланин

3. глутамат

4. лизин

5. триптофан

 

Заменимая аминокислота

1. лейцин

2. лизин

3. фенилаланин

4. пролин

5. изолейцин

 

25. Гидрофобная аминокислота:

1. серин

2. треонин

3. триптофан

4. аспартат

5. глутамин

 

26. Альбумины нерастворимы в:

1. дистиллированной воде

2. фосфатном буфере, рН 6,8

3. насыщенном растворе хлористого натрия

4. полунасыщенном растворе сульфата аммония

5. насыщенном растворе сульфата аммония

27. Смесь белков с различной молекулярной массой нельзя разделить:

1. гель-фильтрацией

2. ионообменной хроматографией

3. диализом

4. электрофорезом

5. высаливанием

28. В образовании третичной структуры белков непосредственно не участвуют связи:

1. дисульфидные

2. гидрофильные

3. ионные

4. пептидные

5. водородные

 

29. Положительную ксантопротеиновую реакцию дает:

1. цистеин

2. метионин

3. триптофан

4. аргинин

5. аспарагин

 

30. Молекулярную массу белков можно определить:

1. ультрацентрифугированием

2. диализом

3. ионообменной хроматографией

4. колориметрически

5. гидролизом

 

31. Незаменимая аминокислота для человека:

1. изолейцин

2. аланин

3. глицин

4. цистеин

5. тирозин

 

32. Гидрофильная аминокислота:

1. валин

2. фенилаланин

3. лейцин

4. лизин

5. изолейцин

 

33. К простым белкам нельзя отнести:

1. протамин

2. коллаген

3. гистоны

4. альбумины

5. гемоглобин

 

34. Для очистки белков от низкомолекулярных примесей используют метод:

1. гель-фильтрации

2. электрофореза

3. ионообменной хроматографии

4. гидролиза

5. все вышеперечисленные

 

35. Положительную реакцию Фоля дает:

1. триптофан

2. гистидин

3. метионин

4. треонин

5. серин

 

36. Число белковых субъединиц в молекуле гемоглобина:

1. одна

2. две

3. три

4. четыре

5. пять

 

37. Чем отличаются разные типы РНК:

1. первичной структурой

2. молекулярной массой

3. последовательностью нуклеотидов

4. функциями в клетке

5. всеми вышеперечисленными параметрами

 

38. Гемопротеином не является:

1. миоглобин

2. цитохром С

3. каталаза

4. гемоглобин

5. казеин

 

39. Белки с различной молекулярной массой можно разделить, используя:

1. трихлоруксусную кислоту

2. гидроокись натрия

3. сульфат меди

4. сульфат аммония

5. все вышеперечисленные соединения

 

40. Олигомерные белки:

1. состоят из нескольких пептидных цепей

2. не содержат α-спиральных участков

3. проходят через полупроницаемую мембрану

4. не обладают четвертичной структурой

Ответы к тестам

1. 2

2. 4

3. 3

4. 5

5. 3

6. 2

7. 3

8. 5

9. 4

10. 4

11. 4

12. 5

13. 5

14. 5

15. 4

16. 4

17. 4

18. 1

19. 3

20. 5

21. 1

22. 3

23. 1

24. 4

25. 3

26. 5

27. 3

28. 4

29. 3

30. 1

31. 1

32. 4

33. 5

34. 1

35. 3

36. 4

37. 5

38. 5

39. 4

40. 1

FРаздел 3e

Ферменты

Ферменты (энзимы) – это простые или сложные белки, катализирующие химические реакции обмена веществ в живых организмах. Таким образом, Ферменты являются биокатализаторами, т. е. ускоряют химические реакции (такой способностью обладают ещё только некоторые РНК, которые называют рибозимами).

Каталитическое действие фермента включает нижеследующие стадии:

1) присоединение молекулы субстрата к ферменту,

2) образование активированного комплекса,

3) отделение конечного продукта реакции от фермента.

Ферменты, являющиеся по своей природе сложным белками, состоят из белковой части (апофермента) и низкомолекулярного компонента (простетической группы, или кофермента). Ферментативное действие оказывает только фермент в целом. Многие коферменты являются производными витаминов и входят в состав активного центра фермента, который определяет каталитическую активность фермента.

Как белковые вещества, ферменты характеризуются термолабильностью и легко теряют активность при температурах, при которых идёт денатурация белка., т.е. выше 50°С. Оптимальной для действия большинства ферментов теплокровных животных является температура 40°С.

Для каждого фермента существует оптимальная область значений рН, в которой он наиболее активен.

Скорость ферментативных реакций зависит от концентрации водородных ионов в среде (рН среды).Физиологическое значение рН среды большинства тканей животных находится в интервале от 6,0 до 8,0.

Ферменты обладают высокой специфичностью действия. В зависимости от механизма действия различают ферменты с абсолютной, относительной (или групповой) и стереохимической специфичностью.

Действие ферментов может усиливаться и тормозиться веществами, которые называются соответственно активаторами и ингибиторами.

Все ферменты согласно международной классификации (КФ) делят по типу катализируемой химической реакции на шесть классов:

1) оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции.

2) трансферазы – осуществляют межмолекулярный перенос различных химических групп.

3) гидролазы – расщепляют внутримолекулярные связи гидролитическим путём.

4) лиазы – катализируют реакции негидролитического распада веществ или присоединения групп по двойным связям и отщепления групп с образованием двойных связей.

5) изомеразы – участвуют в реакциях изомеризации.

6) лигазы (синтетазы) – ускоряют реакции соединения двух молекул, сопряжённые с расщеплением макроэргической связи в молекуле АТФ или аналогичного нуклеозидтрифосфата.

 

Лабораторный практикум в рамках этой темы охватывает изучение специфических фермент-субстратных отношений (амилаза – крахмал), а также определение активности ферментов в биологических жидкостях (амилазы в моче крупного рогатого скота)

Вопросы для внеаудиторной теоретической работы по разделу:

 

1) Биологические катализаторы: рибозимы и ферменты. Понятие о ферментах, их роль в обмене веществ. Химическое строение ферментов. Понятие о коферментах, связь коферментов с витаминами.

2) Кинетика ферментативных реакций, механизм действия ферментов. Специфичность действия ферментов. Регуляция активности ферментов. Аллостерические эффекторы, активаторы и ингибиторы ферментов.

3) Индукция и репрессия ферментов. Понятие о проферментах и изоферментах. Общие принципы определения активности ферментов. Единицы активности ферментов.

4) Международная классификация и номенклатура ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы (синтетазы).

5) Применение ферментов в медицине, ветеринарии, пищевой промышленности и сельском хозяйстве.

Занятие 5.

 

Семинар по теме «Ферменты»

 

1. Вопросы, требующие однозначного ответа «да» (+) или «нет» (-).

1. Специфичность действия сложных ферментов определяется коферментом.

2. Активный центр фермента состоит из субстрат-связывающего и каталитического участков.

3. Активность фермента не зависит от концентрации субстрата.

4. Скорость ферментативной реакции всегда увеличивается с увеличением рН среды.

5. Пепсин обладает абсолютной специфичностью действия.

6. Всегда ли происходит образование фермент-субстратного комплекса в процессе ферментативной реакции?

7. Зависит ли скорость ферментативного процесса от количества присутствующего фермента?

8. Влияют ли ионы тяжелых металлов на активность фермента?

9. Можно ли разделить ферменты методом высаливания сульфатом аммония?

10. Известны ли ферменты, обладающие стереоспецифичностью действия?

 

Вопросы с выборочным ответом

 

Обратимость ферментативной реакции зависит от: 1. температуры 2. ионной силы раствора 3. термодинамического состояния системы 4. концентрации фермента 5. структуры активного центра

К классу оксидоредуктаз не относится фермент: 1. каталаза 2. пероксидаза 3. амилаза 4. аскорбатоксидаза 5. лактатдегидрогеназа

 

Цель работы

Определить время полного расщепления крахмала амилазой слюны.

Принцип метода

Нерасщепленный крахмал с иодом дает синее окрашивание, а декстрины, в зависимости от размера молекул, дают с иодом последовательно фиолетовую, красно-бурую, оранжевую окраску, тогда как мальтоза и глюкоза окрашивания с иодом не дают. Таким образом, можно наблюдать за скоростью расщепления крахмала по реакции с иодом. Активность амилазы в слюне не имеет большого физиологического значения и может значительно отличаться у разных людей.

Выполнение работы

В 9 пробирок наливают по 2 мл дистиллированной воды и добавляют по 1 капле 1% раствора иода. Отдельно в стаканчик наливают 5 мл 0,5% раствора крахмала. Из стаканчика берут пробу - 1 каплю, вносят в первую пробирку и перемешивают, в результате чего раствор в пробирке окрашивается в синий цвет. В стаканчик быстро вносят 5 капель слюны, энергично перемешивают и замечают по секундомеру время. Через 20 секунд берут из стаканчика пробу – 1 каплю и вносят во вторую пробирку. Если жидкость в пробирке станет фиолетовой или красной, то пробы из стаканчика нужно отбирать и вносить в пробирки через каждые 20 секунд. Если жидкость в пробирке № 2 окрасится в синий цвет, то пробы следует отбирать через более длительные интервалы времени, например через 1 минуту. Когда в одной из пробирок цвет раствора иода не изменится, гидролиз крахмала считают законченным. Фиксируют время, затраченное на полное расщепление крахмала. Результаты опыта записывают в виде таблицы:

 

№ пробирок
Окраска жидкости

 

Выводы

Занятие 6.

 

Вопросы с выборочным ответом

 

Фермент, не относящийся к гидролазам: 1. амилаза 2. трипсин 3. каталаза 4. холинэстераза 5. пепсин

Конкурентные ингибиторы: 1. повышают КМ фермента 2. понижают КМ фермента 3. повышают Vmax 4. понижают Vmax 5. не изменяют КМ и Vmax

Цель работы

Определить активность a-амилазы в моче и сравнить с нормой.

Принцип метода

Существует много разных методов определения активности a-амилазы. Мы познакомимся с простым и надежным методом последовательных разведений фермента, предложенным еще в 1929 г. Вольгемутом и сохранившемся до настоящего времени. Метод основан на определении максимального разведения мочи, при котором происходит полное расщепление крахмала (отсутствие цветной реакции с иодом) при заданных условиях.

Выполнение работы

Получение последовательных разведений мочи: в 6 пробирок наливают по 1 мл 0,85% раствора NaCl. В первую пробирку вносят 1 мл мочи (тщательно перемешивают). 1 мл смеси из первой пробирки переносят во вторую, перемешивают. 1 мл из второй пробирки переносят в третью пробирку и т.д. Из последней пробирки, после перемешивания, 1 мл выливают в раковину. В результате получают ряд последовательных разведений мочи:1:2; 1:4; 1:8;1:16 и т.д.

 

№ пробы
Разведение	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64
Окраска
Чем обусловлена окраска

Во все пробирки быстро вносят по 2 мл 0,1% раствора крахмала. Инкубируют 30 минут при комнатной температуре. В каждую пробирку добавляют по 1 капле 1% раствора йода и тщательно перемешивают. Окраску раствора в пробирках заносят в таблицу.

Отмечают последнюю пробирку, в которой произошло полное расщепление крахмала (желтое окрашивание с иодом) и рассчитывают активность a-амилазы.

Расчет активности a-амилазы

За условную единицу активности (ед. Вольгемута) принимают активность необходимую для расщепления 1 мл 0,1% раствора крахмала при комнатной температуре за 30 мин.

А = 2 ^. Р [ед. Вольгемута]

2 (мл) – объем 0,1% крахмала

Р – разведение (см. таблицу), например 1-я пробирка – разведение 2,

6-я пробирка – разведение 64.

Норма: от 16 до 64 условных единиц Вольгемута.

Выводы

f Раздел 4 e

Витамины

Витамины – низкомолекулярные органические соединения различной химической структуры (изопреноиды, производные пиримидина, птеридина и др.), которые не синтезируются в организме человека и животных и относятся к незаменимым факторам питания. Иными словами, витамины - эссенциальные (жизненно важные) факторы питания, необходимые для протекания разнообразных химических процессов в организме.

Витамины отличаются от других органических соединений: они не входят в структуру тканей и не используются в качестве источника энергии. Не все витамины, необходимые для человека, необходимы для животных. Так например, витамин С (аскорбиновая кислота) необходим для человека, приматов и морских свинок, а кролики, крысы и некоторые другие животные могут самостоятельно его синтезировать.

При недостаточном поступлении витаминов с пищей в организм, а также при полном отсутствии их в пище, либо при нарушении их всасывания развиваются тяжёлые заболевания – авитаминозы.

Гиповитаминозом считают недостаточное поступление витаминов или неполное их усвоение, гипервитаминозом – избыточное потребление витаминов. Гипервитаминозы встречаются реже, чем гиповитаминозы, и это сос