Лабораторная работа: «Действие амилазы на крахмал».

 

Фермент амилаза (a-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, КФ: 3.2.1.1) осуществляет гидролиз крахмала через промежуточные продукты распада (декстрины) до мальтозы. Последняя под влиянием фермента мальтазы расщепляется на две молекулы глюкозы. В слюне содержатся амилаза и мальтаза, так что слюна способна расщеплять крахмал до глюкозы.

Основным источником амилазы в организме человека является поджелудочная железа, секретирующая фермент в кишечник, где происходит расщепление поступающего с пищей крахмала.

Цель работы

Определить время полного расщепления крахмала амилазой слюны.

Принцип метода

Нерасщепленный крахмал с иодом дает синее окрашивание, а декстрины, в зависимости от размера молекул, дают с иодом последовательно фиолетовую, красно-бурую, оранжевую окраску, тогда как мальтоза и глюкоза окрашивания с иодом не дают. Таким образом, можно наблюдать за скоростью расщепления крахмала по реакции с иодом. Активность амилазы в слюне не имеет большого физиологического значения и может значительно отличаться у разных людей.

Выполнение работы

В 9 пробирок наливают по 2 мл дистиллированной воды и добавляют по 1 капле 1% раствора иода. Отдельно в стаканчик наливают 5 мл 0,5% раствора крахмала. Из стаканчика берут пробу - 1 каплю, вносят в первую пробирку и перемешивают, в результате чего раствор в пробирке окрашивается в синий цвет. В стаканчик быстро вносят 5 капель слюны, энергично перемешивают и замечают по секундомеру время. Через 20 секунд берут из стаканчика пробу – 1 каплю и вносят во вторую пробирку. Если жидкость в пробирке станет фиолетовой или красной, то пробы из стаканчика нужно отбирать и вносить в пробирки через каждые 20 секунд. Если жидкость в пробирке № 2 окрасится в синий цвет, то пробы следует отбирать через более длительные интервалы времени, например через 1 минуту. Когда в одной из пробирок цвет раствора иода не изменится, гидролиз крахмала считают законченным. Фиксируют время, затраченное на полное расщепление крахмала. Результаты опыта записывают в виде таблицы:

 

№ пробирок
Окраска жидкости

 

Выводы

Занятие 6.

 

Семинар «Ферменты» (продолжение)

1. Вопросы, требующие однозначного ответа «да» (+) или «нет» (-)

1. Связано ли действие некоторых лекарственных препаратов с ингибированием отдельных ферментов?

2. Все ферменты состоят из субъединиц.

3. Константа Михаэлиса выражается в единицах концентрации субстрата.

4. Изоферменты катализируют одну и ту же химическую реакцию.

5. Первая цифра в шифре фермента обозначает, к какому классу он относится.

6. Осуществляют ли лигазы расщепление соединений по двойным связям?

7. Существуют ли мультиферментные комплексы?

8. Изменяется ли константа Михаэлиса в присутствии конкурентного ингибитора?

9. Всегда ли ингибирование фермента необратимо?

10. Используют ли препараты очищенных ферментов в терапевтических целях?

 

Вопросы с выборочным ответом

 

Фермент, не относящийся к гидролазам: 1. амилаза 2. трипсин 3. каталаза 4. холинэстераза 5. пепсин

Конкурентные ингибиторы: 1. повышают КМ фермента 2. понижают КМ фермента 3. повышают Vmax 4. понижают Vmax 5. не изменяют КМ и Vmax

Лабораторная работа: «Определение активности амилазы в моче крупного рогатого скота» по Вольгемуту.

 

a-Амилаза (К.Ф. 3.2.1.1) – фермент, катализирующий гидролитическое расщепление 1,4-a-гликозидных связей в молекулах крахмала и гликогена.

В организме человека основными источниками a-амилазы являются поджелудочная железа и слюнные железы, в которых существует 2 семейства изоферментов амилазы, соответственно P и S.

Изоферменты P – образуются только в поджелудочной железе. Изоферменты S – преимущественно в слюнных железах, а также в других органах и тканях. Доля изоферментов P в общей активности a-амилазы значительно выше в моче, чем в сыворотке крови.

 

Резкое (в 10-30 раз) повышение содержания (и соответственно активности) a-амилазы в сыворотке крови и в моче наблюдается при остром панкреатите (в первые сутки).

Цель работы

Определить активность a-амилазы в моче и сравнить с нормой.

Принцип метода

Существует много разных методов определения активности a-амилазы. Мы познакомимся с простым и надежным методом последовательных разведений фермента, предложенным еще в 1929 г. Вольгемутом и сохранившемся до настоящего времени. Метод основан на определении максимального разведения мочи, при котором происходит полное расщепление крахмала (отсутствие цветной реакции с иодом) при заданных условиях.

Выполнение работы

Получение последовательных разведений мочи: в 6 пробирок наливают по 1 мл 0,85% раствора NaCl. В первую пробирку вносят 1 мл мочи (тщательно перемешивают). 1 мл смеси из первой пробирки переносят во вторую, перемешивают. 1 мл из второй пробирки переносят в третью пробирку и т.д. Из последней пробирки, после перемешивания, 1 мл выливают в раковину. В результате получают ряд последовательных разведений мочи:1:2; 1:4; 1:8;1:16 и т.д.

 

№ пробы
Разведение	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64
Окраска
Чем обусловлена окраска

Во все пробирки быстро вносят по 2 мл 0,1% раствора крахмала. Инкубируют 30 минут при комнатной температуре. В каждую пробирку добавляют по 1 капле 1% раствора йода и тщательно перемешивают. Окраску раствора в пробирках заносят в таблицу.

Отмечают последнюю пробирку, в которой произошло полное расщепление крахмала (желтое окрашивание с иодом) и рассчитывают активность a-амилазы.

Расчет активности a-амилазы

За условную единицу активности (ед. Вольгемута) принимают активность необходимую для расщепления 1 мл 0,1% раствора крахмала при комнатной температуре за 30 мин.

А = 2 ^. Р [ед. Вольгемута]

2 (мл) – объем 0,1% крахмала

Р – разведение (см. таблицу), например 1-я пробирка – разведение 2,

6-я пробирка – разведение 64.

Норма: от 16 до 64 условных единиц Вольгемута.

Выводы

f Раздел 4 e

Витамины

Витамины – низкомолекулярные органические соединения различной химической структуры (изопреноиды, производные пиримидина, птеридина и др.), которые не синтезируются в организме человека и животных и относятся к незаменимым факторам питания. Иными словами, витамины - эссенциальные (жизненно важные) факторы питания, необходимые для протекания разнообразных химических процессов в организме.

Витамины отличаются от других органических соединений: они не входят в структуру тканей и не используются в качестве источника энергии. Не все витамины, необходимые для человека, необходимы для животных. Так например, витамин С (аскорбиновая кислота) необходим для человека, приматов и морских свинок, а кролики, крысы и некоторые другие животные могут самостоятельно его синтезировать.

При недостаточном поступлении витаминов с пищей в организм, а также при полном отсутствии их в пище, либо при нарушении их всасывания развиваются тяжёлые заболевания – авитаминозы.

Гиповитаминозом считают недостаточное поступление витаминов или неполное их усвоение, гипервитаминозом – избыточное потребление витаминов. Гипервитаминозы встречаются реже, чем гиповитаминозы, и это состояние наблюдается чаще всего при избыточном поступлении витаминов А, D, К. Причины гипо- и авитаминозов у человека и животных делят на экзогенные и эндогенные.

 

Таблица. Причины гипо- и авитаминозов у человека и животных

Экзогенные причины	Эндогенные причины
· недостаточное поступление витаминов · полное отсутствие витаминов в пище	· дефицит витаминов вследствие повышенного расходования витаминов при заболеваниях, связанных с нарушением всасывания их в желудочно-кишечном тракте; · дефицит витаминов при заболеваниях печени; · возрастающее потребление витаминов при некоторых физиологических состояниях (беременность, лактация, тиреотоксикоз и др.); · нарушение транспорта и метаболизма витаминов (превращение в кофермент)

 

Современная классификация витаминов основана на физико-химических свойствах (в частности, на растворимости).

 

По растворимости витамины подразделяются на жирорастворимые (А, D, E и К) и водорастворимые (В₁, В₂, В₃, В_с, В₆, В₁₂, РР, Р, Н, С). В химическом отношении жирорастворимые витамины А, D, E и К относятся к изопреноидам, водорастворимые витамины (группы В, витамин С, витамин Н) содержат разнообразные химические структуры. Наиболее сложную химическую структуру имеет витамин В₁₂ (цианокобаламин).

 

Помимо перечисленных витаминов, в организме человека и животных синтезируется группа соединений, обладающих витаминными свойствами (витаминоподобные вещества): холин, липоевая кислота, оротовая кислота, витамин U, карнитин и др.

Большинство витаминов являются предшественниками коферментов, а некоторые из витаминов выполняют сигнальные функции (ретиноевая кислота выполняет функции ростового фактора).

Витамины участвуют в обмене веществ как в качестве коферментов – непосредственных участников ферментативных реакций (витамины группы B, витамин РР), так и в виде регуляторов отдельных процессов (витамины С, А, Е, К, D).

Основным источником витаминов являются пищевые продукты растительного и животного происхождения, и лишь некоторые из них (фолиевая кислота, биотин, витамин К) способны синтезироваться микрофлорой кишечника.

Суточная потребность человека в витаминах зависит от возраста, пола и физиологического состояния организма (период беременности и кормления, физические нагрузки). Животные в зависимости от строения желудочно-кишечного тракта испытывают разную потребность в витаминах. Так, жвачные животные в отличие от многастричных животных менее чувствительны к недостатку витаминов группы В, поскольку у них в рубце активно идёт их микробный синтез. При стрессах для многих животных возрастает потребность в витамине С.

Признаки гипо- и авитаминозов у человека и животных также различаются, а суточная потребность в витамине определяется не массой животного, а зависит от видовой принадлежности животного, сезонности, возраста и других факторов.

Определение витаминов в продуктах питания, микробиологических средах, а также стандартизация препаратов витаминов представляют большой практический интерес. В данном практикуме предложена методика оценки содержания витамина С в картофеле.

Вопросы для внеаудиторной теоретической работы по разделу:

1) Жирорастворимые витамины.

Витамины группы А. Строение, источники витамина А. Биологическая роль витамина А.

Витамины группы D. Провитамины D₂ и D₃: эргостерин, 7-дегидрохолестерин. Участие витамина D в регуляции обмена кальция и фосфора. Роль витамина D и кальцитриола в обмене веществ.

Витамины группы К. Источники витамина К. Участие витамина К в свертывании крови.

Витамины группы Е. Строение и источники витамина Е. Биологическая роль витамина Е.

2) Водорастворимые витамины.

Витамин В₁. — тиамин. Химическое строение. Биологическая роль витамина В₁ и значение его кофермента ТПФ в обмене веществ. Потребность животных в витамине В₁.

Витамин В₂ — рибофлавин. Химическое строение. Распространение в пищевых продуктах. Биологическая роль витамина В₂. Его участие в синтезе коферментов (ФАД, ФМН). Потребность в витамине В₂ у животных.

Витамин В₃ – пантотеновая кислота. Участие пантотеновой кислоты в структуре кофермента А. Биологическая роль витамина В₃.

Витамин В₆ – пиридоксин. Химическое строение. Авитаминоз В₆ у животных и птиц. Биологическая роль витамина В₆ и его участие в образовании коферментов (пиридоксальфосфата и пиридоксаминфосфата).

Витамин РР – никотиновая кислота и никотинамид (ниацин). Биологическая роль никотинамида и его участие в образовании коферментов НАД⁺ и НАДФ⁺.

Витамин С, биотин, фолиевая кислота. Природные источники. Биологическая роль этих витаминов.

Занятие 7.