Особенности культивирования риккетсий, хламидий, микоплазм

Риккетсии являются облигатными внутриклеточными паразитами и не размножаются на искусственных питательных средах. Для их культивирования используют живые системы.

Эпидермо-мембранный метод (метод А.В. Пшеничного и Б.И. Райхера). Принцип его заключается в том, что с кожи трупа снимают путем термической обработки эпидермальный слой в виде тонкой пленки, то есть тончайшей мембраны. Эпидермальную мембрану натягивают на кормушку и закрепляют. На мембрану высыпают вшей, а под мембрану подводят небольшое количество дефибринированной крови, содержащей риккетсии. Кормушку нагревают до 32 – 37°С. Вши сосут кровь и заражаются риккетсиями. Размножаясь в эпителиальных клетках кишечника риккетсии через 8 – 9 дней накапливаются во вшах. Затем их растирают в ступке, и взвесь очищают путем фильтрации и центрифугирования (в настоящее время метод имеет историческое значение).

Метод Кокса (заражение куриных эмбрионов в полость желточного мешка). Для этого используют 6 – 7-дневные эмбрионы. Работа производится в боксах с тщательным соблюдением стерильности. После дезинфекции 50% спиртом и 5% йодной настойкой скорлупы тупого конца яйца пробуравливают отверстие над вершиной воздушной камеры и в него вводят шприц, содержащий 0,4 – 0,5 мл инфицирующего материала. Контролируя положение иглы с помощью овоскопа, прокалывают хорион-аллантоисную оболочку, проходят аллантоисную полость и входят в желточный мешок. Отверстие в скорлупе закрывают расплавленным стерильным парафином, и зараженные эмбрионы помещают в термостат при 35 – 37°С. Максимальное накопление риккетсий происходит на 8 – 10-й день. Риккетсии размножаются в ткани стенки желточного мешка и при гибели клеток легко из них освобождаются. При вскрытии зараженных эмбрионов желточный мешок извлекают стерильным пинцетом и из него готовится суспензия на стерильном физиологическом растворе, которую используют для приготовления риккетсиозных антигенов и вакцин.

Метод культуры тканей. Риккетсии можно выращивать в культурах in vitro на многих типов клеток млекопитающих: Hep-2, HeLa, Detroit-6 (костный мозг грудины человека), L-мышиных фибробластах, фибробластах куриных эмбрионов и других. Метод культуры ткани не нашли широкого применения для выделения и идентификации риккетсий, но позволили выяснить вопросы взаимоотношения возбудителя с клеткой-хозяином. Риккетсии в культуре клеток накапливаются медленно и в небольшом количестве, поэтому клеточные культуры нужно поддерживать в течение нескольких недель, прежде чем появятся признаки инфекции. При инфицировании клеток риккетсии не остаются в цитоплазме до ее деструкции, а свободно выходят и проникают в соседние клетки. Температурный оптимум – 32 – 35°С, рН – 7,4 – 7,8, солевой состав в культуральной среде обеспечивается смесью жидкости Тироде с сывороткой морской свинки или кролика.

Метод заражения лабораторных животных (биологический метод). В настоящее время для культивирования риккетсий широко используют морских свинок и белых мышей. Других животных заражают редко, только для специальных исследований. Морских свинок заражают внутрибрюшинно или интратестикулярно (в толщу яичек). У животных развивается лихорадка, а в случае эндемических риккетсиозов развивается специфический периорхит, сопровождающийся накоплением риккетсий в мезотелии влагалищных оболочек яичка. Риккетсии выделяют из крови, селезенки, почек, надпочечников, но особенно много их в мозговой ткани животного.

Для размножения риккетсий Провачека чаще всего используют белых мышей, заражая их интраназально. Наиболее чувствительны молодые мыши, весом 10 – 15 г. Инфицирование их производится под эфирным наркозом с инсталляцией в ноздри 10 капель риккетсиальной взвеси. При такой дозе мыши погибают на 4 – 5 сут. При вскрытии извлекают легкое, из которого, в среднем, получают до 20 – 25 млрд. риккетсий.

 

Хламидии вызывают у человека орнитоз, трахому, бленнорею новорожденных с включениями, болезнь Рейтера, венерическую лимфогранулёму, урогенитальные инфекции. Хламидии, как и риккетсии культивируются в организме чувствительных животных, в культурах тканей, в желточном мешке куриного эмбриона.

Биологический метод. Исследуемым материалом заражают новорожденных морских свинок и белых мышей. Новорожденные мыши погибают при внутримозговом заражении через 5 – 10 сут от пневмонии. При внутрибрюшинном заражении гибель животных отмечается на 3 – 4 сут на фоне пневмонии и перитонита. При микроскопическом исследовании клеток пораженных органов обнаруживаются хламидийные включения, наибольшее количество возбудителя отмечается в легких, печени, селезенке.

Заражение куриных эмбрионов. Наиболее эффективно заражение 7-дневных куриных эмбрионов в желточный мешок и 9 – 11-дневных – в полость аллантоиса. Гибель эмбрионов происходит уже на 4 сут, температура инкубации 36°С. Препараты, отпечатки и мазки, окрашивают акридиновым оранжевым, по Романовскому-Гимзе, Макклавелла и исследуют под микроскопом для обнаружения включений. При отрицательных результатах делают слепые пассажи, то есть из желточных мешков готовят 20% суспензию на фосфатном буфере, которой вновь заражают партию новых куриных эмбрионов.

Метод культуры тканей. Исследуемым материалом заражают культуры клеток – L; Hep-2; HeLa; линии клеток Мак-Коя. Эффективность заражения клеток хламидиями возрастает при обработке культуры цитостатиками или центрифугирования после внесения инфицированного материала в культуру. Культуры клеток обычно выращивают на покровных стеклах, которые фиксируют и красят через 24 – 28 час после заражения. Если цитоплазматические включения хламидий не обнаруживаются, культивирование продолжают до 6 – 10 сут (температура 35 – 36°С). К этому сроку при наличии хламидий в монослое клеток формируются цитолитические бляшки (зоны гибели клеток).

 

Микоплазмы являются хемоорганотрофами, факультативными анаэробами, хотя лучше растут в аэробной среде и только немногие виды – в анаэробных условиях. Они прихотливы к условиям культивирования; в питательные среды необходимо вносить нативную сыворотку, холестерин, нуклеиновые кислоты, витамины, различные соли. Питательные среды могут быть полужидкие, жидкие и плотные, состоящие из 7 частей основной среды (перевар сердечной мышцы крупного рогатого скота), 1 части 25%-ного экстракта свежих дрожжей и 2 частей непрогретой лошадиной сыворотки (среды, разработанные В.Д. Тимаковым, Г.Я. Каган). За рубежом широкое использование получили жидкая и плотная питательные среды фирмы Дифко, а также дифференциальная агаровая среда А-7. Оптимальная температура для роста микоплазм в агаровых культурах 36,5 – 37°С, рН – 7,0, при повышении рН до 8 микоплазмы гибнут.

При нанесении капли материала, содержащего микоплазмы, она адсорбируется агаром, образуя уплотнение между его нитями. В результате размножения микоплазм, внутри нитей агара формируется маленькая сферическая колония, которая растет и через 24 – 28 часов инкубации достигает поверхности водной пленки, в результате образуются две зоны роста – мутный гранулярный центр, врастающий в среду, и плоская ажурная полупросвечивающая периферическая зона (вид «глазуньи»). Спустя 3 – 5 сут инкубации колонии могут достигать размера 1,5 – 2 мм, но чаще они так малы, что их трудно увидеть невооруженным глазом и посевы просматривают при малом увеличении микроскопа. Микоплазмы образуют колонии более крупные, чем уреаплазмы (15 – 60 мкм в диаметре).

На полужидких средах микоплазмы растут по ходу посева уколом, формируя крошковатые колонии, а на жидких питательных средах вызывают опалесценцию или тонкую жирную пленку, а иногда придонный рост.

Патогенные микоплазмы хорошо размножаются в культурах тканей (Hep-2, HeLa), вызывая через 72 – 86 час резкую дегенерацию клеток – цитопатогенный эффект, сапрофитные виды таким свойствам не обладают. Кроме того, в литературе имеются отдельные сообщения об успешном моделировании экспериментальной уреаплазменной инфекции на обезьянах при интрауретральном инфицировании свежевыделенными штаммами микоплазм человеческого происхождения.

 

7.3. Демонстрация преподавателем методики практических приемов по данной теме.

Преподаватель знакомит обучающихся с планом и методикой проведения практической работы.

7.4. Самостоятельная работа обучающихся под руководством преподавателя.

Выделение чистой культуры аэробных и факультативно-анаэробных бактерий на примере выделения чистой культуры кишечной палочки (E. coli) из ее смеси со стафилококком методом Дригальского (второй этап).

На поверхности плотной питательной среды микроорганизмы образуют сплошной, густой рост или изолированные колонии. Колония – это видимые невооруженным глазом скопления бактерий на поверхности или в толще питательной среды. Как правило, каждая колония формируется из потомков одной микробной клетки (клоны), потому их состав достаточно однороден. Особенности роста бактерий на питательных средах являются проявлением их культуральных свойств.

Признаки, обнаруживаемые в проходящем свете (рассматривают чашку со стороны дна, держа её на уровне глаз): величина колоний в мм (крупная – диаметром более 4 – 6 мм, средняя – 2 – 4 мм, мелкая – 1 – 2 и точечная – меньше 1 мм); форма (округлая, амебоидная, ризоидная); прозрачность (прозрачная, матовая, флуоресцирующая, полупрозрачная, непрозрачная, блестящая).

Признаки, обнаруживаемые в отражённом свете (рассматривают чашку со стороны посева, под дно чашки рекомендуется подложить лист белой бумаги): высота, рельеф (плоская, выпуклая, кратерообразная, врастающая в агар); характер поверхности (гладкая, шероховатая, складчатая, бугристая); цвет (пигментация).

Гладкие колонии обозначают буквой S (smooth), шероховатые – буквой R (rough), что означает соответственно «гладкий» и «шероховатый». Механизм формирования гладких и шероховатых форм колоний обусловлен различием процессов клеточного деления. Микробные клетки в колониях S-форм располагаются, соприкасаясь своими боковыми поверхностями, клетки R-форм, сохраняя при делении цитоплазматические мостики, образуют цепочки, которые, накладываясь друг на друга, обусловливают шероховатую поверхность и неровный край колонии.

Признаки, обнаруживаемые под малым увеличением микроскопа. Чашку укладывают вверх дном на предметный столик и рассматривают под малым увеличением микроскопа. Отмечают характер края колонии (ровный, волнистый, лопастной, ризоидный) и структуру колонии (гомогенная, зернистая, волокнистая).

При приготовлении препаратов для микроскопии, касаясь петлёй колоний, отмечают её консистенцию. Колония может быть мягкой, вязкой, слизистой (тянется за петлёй), плотной, спаянной с агаром.

 

Задание 1