Методы культивирования анаэробных бактерий.

Для культивирования анаэробов необходимо создать сниженное парциальное содержание кислорода в среде или в воздухе, с которым она соприкасается, что достигается механическими, физическими, химическими и биологическими способами.

Механические методы удаления кислорода

Наиболее простыми способами являются посев анаэробной культуры уколом в высокий столбик сахарного агара или на среду Вильсона-Блера.

1. Посев анаэробной культуры уколом в высокий столбик сахарного агара. В пробирку с 6 – 7 мл расплавленного и охлаждённого до 40 – 45°С полужидкого питательного агара, содержащего 0,5 – 1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.

2. Способ Виньяль-Вейона. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до 40 – 45°С сахарным агаром вносят исследуемый материал и перемешивают. При необходимости материал разводят путём переноса в последующие 2 – 3 пробирки с расплавленным агаром. Содержимое пробирок набирают в пастеровские пипетки. После заполнения пипетки вытянутый конец запаивают, а противоположный конец закрывают стерильной ваткой и заливают парафином. Трубки помещают в термостат; через 2-3 суток в агаре вырастают глубинные колонии, видимые в проходящем свете, которые можно изолировать. Для этого трубку надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию извлекают петлёй и пересевают для накопления чистой культуры в соответствующую питательную среду.

3. Метод Перетца. В пробирку с растопленным и остужённым до 45⁰ сахарным агаром вносится и размешивается исследуемая культура. Смесь выливается в стерильную чашку Петри, охлаждается. На поверхность накладывается стерильное стекло. Чашку в закрытом виде помещают в термостат на 18 – 20 часов. Под стеклом вырастают колонии, которые извлекают, отодвинув стекло.

Физические методы удаления кислорода

1. Анаэростат используется для создания вакуума с дозированным содержанием кислорода. Прибор представляет собой герметически закрывающийся сосуд, снабжённый манометром. В сосуд помещают посевы и откачивают воздух. Анаэростат помещают в термостат.

2. Эксикатор – стеклянный лабораторный сосуд с притёртой крышкой. В его донной части имеется дополнительная емкость, куда наливается смесь пирогаллола и едкого натра или гидросульфита натрия и двууглекислой соды. На сетку-подставку помещают посевы и притирают крышку с помощью вазелина. Эксикатор помещают в термостат.

Колонии анаэробов в вакуумных условиях растут на поверхности плотной питательной среды.

3. Аппарат Киппа. Воздух заменен водородом, который через присоединенную трубку поступает в сосуд, где помещены посевы анаэробов, вытесняя из него воздух с кислородом.

Аппарат Киппа состоит из трёх стеклянных сосудов; средний и нижний соединены перетяжкой, через которую проходит длинная трубка, служащая для сообщения верхнего сосуда с нижним. Твёрдое вещество (например, при получении водорода - цинк) помещают в средний сосуд, снабженный газоотводной трубкой с краном. В верхний наливают жидкость (например, разбавленную соляную кислоту), которая, заполнив нижний сосуд, поступает в средний и взаимодействует с твёрдым веществом. Выделяющийся газ выходит через газоотводную трубку.

4. Среда Китт-Тароцци (МПБ, 0,5 % глюкозы и 0,15% агара). На дно пробирки для адсорбции кислорода помещают кусочки варёной печени или фарша слоем 1 – 1,5 см и заливают 6 – 7 мл среды. Кусочки органов, а также глюкоза обладают рецидивирующими свойствами (свойство поглотителя свободного кислорода). Среду перед посевом прогревают 15 – 20 мин на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают. После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.