Методы индикации бактериофагов

Наличие фага в исследуемом материале – фильтрате исходного материала (воды, суспензии фекалий и т.п.) определяют качественными и количественными методами. 

Качественные методы. Присутствие фага в фильтрате определяют по его лизирующему действию на соответствующую бактериальную культуру.

1. Индикация фага в жидкой питательной среде. В пробирку с суточной бульонной культурой чувствительных к фагу бактерий (тесткультурой) вносят исследуемый фильтрат. Инкубируют в термостате 18 – 20 час при 37°С. Задержка роста бактерий, то есть прозрачный бульон, является показателем наличия соответствующего фага в фильтрате.

2. Индикация фага на твердой питательной среде по Отту. Тест-культуру, например, дизентерийную культуру, засевают на поверхность МПА в чашке Петри и сверху дорожкой наносят исследуемый фаг (фильтрат). Инкубируют в термостате 18 – 20 час при 37°С. При соответствии фага с данной культурой отмечается задержка роста бактерий по ходу дорожки.

Количественные методы - титрование бактериофагов.

1. Титрование бактериофагов на плотной питательной среде по Грациа. Для титрования необходимы следующие компоненты:

а) пробирки с различными разведениями бактериофага с полужидким агаром (десятикратные разведения исследуемой суспензии фага - 10^-2 – 10^-7 в зависимости от предполагаемого титра);

б) ряд чашек Петри с МПА;

в) суточная бульонная культура чувствительная к фагу бактерий (E. сoli, S.aureus или другие тест-культуры).

Смешивают разведения фага с суточной бульонной культурой и выливают на поверхность МПА в чашку Петри, где она застывает в виде тонкой плёнки, в которой неподвижно фиксированы бактерии. Чашки инкубируют при 37°С в течение 18 – 24 часов. При этом незаражённые бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности агара. Каждая инфицированная фагом бактерия лизируется.

В результате на сплошном бактериальном газоне появляются четко очерченные зоны лизиса – негативные колонии. Число негативных колоний равно количеству жизнеспособных фаговых частиц в засеянной смеси. Титр фага определяют по последней чашке, где появляются негативные колонии, то есть титром фага называется то максимальное разведение, при котором появляются негативные колонии.

2. Титрование бактериофага в жидких средах по Аппельману.

В 9 пробирках приготавливают десятикратные разведения исследуемой суспензии фага с МПБ. В качестве контроля берут МПБ без бактериофага. Во все пробирки добавляется по 0,25 мл культуры бактерий, например, E.сoli. Засеянные пробирки помещаются в термостат на 24 часа при 37°С, после чего отмечаются результаты опыта.

Титром бактериофага называется то наибольшее его разведение, при котором наблюдается полный лизис бактерий (бульон остается прозрачным).

 

7.3. Демонстрация преподавателем методики практических приемов по данной теме.

Преподаватель знакомит обучающихся с планом и методикой проведения практической работы.

Демонстрация готовой реакции фаголизиса и реакции фаготипирования St. аureus.  

Реакция фаголизиса

Реакция фаголизиса применяется для идентификации выделенной чистой культуры бактерий по фагочувствительности. Реакцию ставят в двух пробирках: №1 (опыт) и №2 (контроль). Реакция фаголизиса изучаем на примере идентификации выделенной чистой культуры S.sonnei из испражнения при подозрении на дизентерию.

 

Реакция фаголизиса

 

Компоненты реакции	Пробирка №1 (опыт)	Пробирка №2 (контроль)
МПБ	+	+
Дизентерийная культура (S.sonnei)	+	+
Монофаг S. Sonnei	+	+

 

Посевы инкубируют в термостате 18 – 24 часов при 37°С. При наблюдении за посевами впервые часы бульон в пробирках слегка мутнеет вследствие размножения бактерий. В дальнейшем в контрольной пробирке (без бактериофага) помутнение усиливается; в пробирке с бактериофагом через 6 часов происходит просветление в результате лизиса бактерий.

Учет реакции проводятся по просветлению МПБ в результате лизируещего действия монофага на бактерии.

Реакция фаготипирования S.aureus

Определение фаготипа проводится с помощью специальных наборов типовых фагов и является одним из методов внутривидовой дифференциации бактерий. Реакция фаготипирования применяется с целью установления источников и путей передачи инфекции при госпитальных, кишечных заболеваниях и пищевых отравлениях.

Испытуемую суточную бульонную культуру S.aureus равномерно распределяют на поверхности подсушенного агара в чашке Петри. Дно чашки расчерчивают на 22 квадрата по числу фагов, затем капают фаги по одному в каждый квадрат. Посев инкубируют в термостате 18 – 24 часа при температуре 37°С.

На 2-й день проводят учёт результатов; фаготип культуры соответствует тому фагу, который вызывает её полный лизис. Также проводится фаготипирование брюшнотифозных (44 типа) и паратифозных бактерий (15 типов), энтеропатогенных эшерихий (24 типа).

 

Самостоятельная работа обучающихся под руководством преподавателя.

 

Задание 1