Структура вирусов, их репродукция и культивирование. Вирусологический метод исследования. Вирусы бактерий (бактериофаги).

Актуальность темы.

Вирусы человека являются возбудителями многих инфекционных заболеваний: гриппа, кори, ГЛПС, СПИДа, и т.д. Изучение вирусов начинается с изучения общей вирусологии, физиологии и биохимии вирусов и вирусов бактерий (бактериофагов).

Бактериофаги являются вирусами бактерий. Они представлены в природе и нашли широкое применение в медицине при лечении различных гнойных заболеваний.

 

Учебные цели:

Изучить морфологию, физиологию и биохимию вирусов, принципов лабораторной диагностики вирусных инфекций, методов индикации и идентификации вирусов.

Для формирования профессиональных компетенцийобучающиеся должны знать:

ü классификацию, строение и свойства вирусов, репродукцию вирусов, основные стадии взаимодействия вирусов и клетки;

ü методы культивирования вирусов;

ü технику заражения вирусом куриного эмбриона;

ü особенности репродукции ДНК- и РНК- содержащих вирусов;

ü современные методы вирусологических исследований;

ü методы индикации и идентификации вирусов;

ü классификацию, строение и свойства бактериофагов;

ü репродукцию бактериофагов, основные стадии взаимодействия бактериофагов и клетки;

ü методы культивирования бактериофагов;

ü методы индикации бактериофагов.

Для формирования профессиональных компетенций студент должен уметь:

ü заражать и вскрывать куриный эмбрион;

ü ставить реакцию гемагглютинации и торможения гемадсорбции;

ü отличить бактериофаги от вирусов;

ü провести титрование бактериофагов и фаготипирование, овладеть навыками индикации бактериофагов, идентифицировать культуру по чувствительности к бактериофагу.

В результате освоения темы обучающийся должен владеть методикой

ü заражения и вскрытия куриного эмбриона;

ü проведения реакции гемагглютинации и торможения гемадсорбции;

ü титрования бактериофагов и фаготипирования;

ü индикации бактериофагов;

ü идентификации культуры по чувствительности к бактериофагу.

ü компетенциями: ОК-1, ОПК-7, ПК-1, ПК-3, ПК-13, ПК-18 и трудовыми функциями А/04.7, А/05.7, А/06.7.

 

3. Вопросы для самоподготовки к освоению данной темы

1) Царство Virae. Понятие о вирионе и вирусе, их определение. Вирусы человека, животных, насекомых, растений, бактерий (фаги). Современные принципы классификации и номенклатуры вирусов.

2) Вирионы, их морфология и структура (нуклеоид, капсид, капсомеры). Типы симметрии нуклеокапсида. Внешняя оболочка.

3) Химический состав вирионов (ДНК или РНК, белки, липиды, полисахариды).

4) Вирусоспецифические ферменты, содержащиеся в вирионе и индуцированные в клетке хозяина.

5) Гемагглютинирующие и гемадсорбирующие свойства вирусов.

6) Репродукция вирусов. Основные стадии взаимодействия вирусов с клетками хозяина при продуктивной инфекции. Особенности репродукции ДНК- и РНК-содержащих вирусов.

7) Понятие о вирогении, её механизмы и последствия для клетки.

8) Методы культивирования вирусов в клеточных структурах (первичных, перевиваемых, полуперевиваемых), в куриных эмбрионах и в организме животных.

9) Методы обнаружения (индикации) вирусов по цитопатическому действию.

10)Методы титрования вирусов.

11)Царство Virae. Понятие о бактериофагах, их определение. Современные принципы классификации и номенклатуры бактериофагов.

12)Морфология и структура бактериофагов. Химический состав бактериофагов (ДНК или РНК, белки, липиды, полисахариды).

13)Фагопрофилактика, фагодиагностика, фаготерапия, фаготитрование, препараты бактериофагов.

14)Методы культивирования бактериофагов.

15)Методы обнаружения (индикации) бактериофагов.

 

4. Вид занятия: практическое занятие.

5. Продолжительность занятия: 3 часа (180 мин)

6. Оснащение:

6.1. Таблицы; пробирка с вируссодержащим материалом, куриный эмбрион, пробирка с бактериальным материалом, поливалентные бактериофаги, питательная среда, куриные эмбрионы 8 – 14 дневного возраста инкубации, спиртовые тампоны, подставки для эмбрионов, пинцеты, ножницы, лейкопластырь, иглы, шприцы, простые карандаши, пробойники.

6.2. Мультимедийные атласы, ситуационные задачи, таблицы (электронный вариант), видеофильмы, материал для демонстрации: готовая реакция фаголизиса, фаготипирование бактерий, цитопатические изменения клеток культуры ткани, вызванные репродукцией вируса.

6.3. Технические средства обучения: световые микроскопы, компьютеры, мультимедийный проектор, овоскоп, термостат.

 

7. Содержание занятия.

7.1. Контроль исходного уровня знаний и умений.

Выполнение тестовых заданий, собеседование.

7.2. Разбор с преподавателем узловых вопросов, необходимых для освоения темы занятия.

Понятие о вирионе и вирусе, их определение. Химический состав вирионов. Репродукция вирусов. Методы культивирования вирусов. Морфология и структура бактериофагов. Методы культивирования бактериофагов.

Вирусы

Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты, существуют в двух формах: внеклеточная, покоящаяся форма – вирион и внутриклеточная – вегетативная.

Отличие вирусов от прокариотов:

Ø вирусы содержат только одну из нуклеиновых кислот ДНК или РНК;

Ø не имеют клеточного строения;

Ø не способны к делению и бинарному делению;

Ø не имеют собственных метаболических систем;

Ø воспроизводятся за счет одной нуклеиновой кислоты, а не за счет своих собственных составных частей;

Ø используют рибосомы клетки хозяина для синтеза собственных белков.

Для выделения и культивирования облигатных паразитов (вирусов, риккетсий и хламидий) применяются вирусологические методы: заражение тканевых культур, куриного эмбриона и восприимчивых лабораторных животных. Вирусологическое исследование проводится в два этапа: выделение вируса и идентификация вируса. Материалами для вирусологического исследования могут быть отделяемое носоглотки, испражнения, кровь и другие материалы в зависимости от локализации вируса. Вирусологические методы также применяются для культивирования некоторых факультативных паразитов, например, микоплазмы, бруцелл, франциселл, легионелл и др.

Культуры клеток. Культуры клеток готовят из тканей животных. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые. 

Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде с добавлением телячьей сыворотки крови. 

Перевиваемые культуры адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей. Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

О репродукции вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически и характеризуется морфологическими изменениями клеток. Характер ЦПД вирусов используют как для их обнаружения (индикации), так и для ориентировочной идентификации, т. е. определения их видовой принадлежности.

Цитопатическое действие (ЦПД) – дегенеративные изменения в клетках, которые появляются в результате репродукции в них вирусов. Различают полную и частичную дегенерацию клеток монослоя.

При полной дегенерации клетки подвергаются значительным изменениям, большое количество их слущивается со стекла. Остающиеся клетки сморщены (пиккоз ядра и цитоплазмы). Такой вид дегенерации вызывают вирусы Коксаки и ЕСНО.

Частичная дегенерация имеет несколько видов: частичная дегенерация по типу гроздеобразования, очаговой деструкции и симпластообразования.

При частичной дегенерации по типу гроздеобразования клетки округляются, увеличиваются, частично сливаются между собой с образованием характерных гроздевидных скоплений. Такой тип дегенерации вызывают аденовирусы.

При очаговой деструкции на фоне в целом сохранившегося монослоя появляются очаги пораженных клеток (микробляшки). Такую дегенерацию клеток монослоя вызывают некоторые штаммы вирусов оспы, осповакцины, гриппа.

При частичной дегенерации по типу симпластообразоания под действием вирусов клетки сливаются между собой с образованием гигантских многоядерных клеток – симпластов. Симпластообразование вызывают вирусы кори, паротита, парагриппа, респираторно-синтициальный вирус, вирус герпеса.

Некоторые онкогенные вирусы трансформируют клетки в злокачественные вызывая их интенсивную пролиферацию – пролиферативный тип изменений.

Один из методов индикации вирусов основан на способности поверхности клеток, в которых они репродуцируются, адсорбировать эритроциты – реакция гемадсорбции. Для ее постановки в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клетки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилипшие эритроциты.

Реакция гемадсорбции (РГадс) позволяет выявить вирус до развития ЦПД блягодаря появлению на поверхности инфицированной клетки вирус-специфического антигена.

Реакция гемагглютинации (РГ) применяется для обнаружения вирусов в культуральной жидкости культуры клеток либо хорионаллантоисной или амниотической жидкости куриного эмбриона. 

Механизм реакция гемагглютинации:

1 стадия – адсорбция вирионов на поверхности эритроцитов;

2 стадия – агглютинация эритроцитов, нагруженных вирусами.

Этой способностью обладают арбовирусы, аденовирусы, миковирусы, вирусы Коксаки и ЕСНО. Ингибиторы гемагглютинации нейтрализуют инфекционные свойства вирусов, содержатся в моче, слюне, коровьем молоке, курином белке.

Количество вирусных частиц определяют методом титрования по ЦПД в культуре клеток. Для этого клетки культуры заражают десятикратным разведением вируса. После 6 – 7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД.

Титр вируса – это наибольшее разведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных культур. Титр вируса выражают количеством цитопатических доз.

Более точным количественным методом учета отдельных вирусных частиц является метод бляшек.  

Бляшки или негативные колонии вирусов представляют собой очаги разрушенных вирусом клеток монослоя под агаровым вскрытием. Очаги клеточной дегенерации (бляшки) выявляют путем окрашивания нейтральными красками, которые вводились в состав агарового покрытия, либо добавлялись непосредственно перед учетом результата. По числу бляшек (стерильных пятен) на клеточном монослое определяют инфекционный титр вируса, т.е. концентрацию вирионов в 1 мл среды.

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток.

Внутриклеточные включения образуются при репродукции некоторых вирусов в цитоплазме и ядре клеток (оспы, бешенства, гриппа, герпеса). Их обнаруживают при микроскопии после окраски стекол с монослоем по Романовскому-Гимзе. Электронная микроскопия дает возможность выявить в клетках отдельные вирионы и их кристаллоподобные скопления в ядре или цитоплазме. Диагностическое значение имеют тельца Гварниери при натуральной оспе и тельца Бабеша-Негри – при бешенстве.

Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы   по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям. Для получения чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8 – 12-дневные куриные эмбрионы.

О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его оболочках. О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами.

К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов.

Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных к определенному вирусу и их возраст определяют репродуктивную способность вирусов. Во многих случаях только новорожденные животные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки – к вирусам Коксаки).

Преимущество данного метода перед другими состоит в возможности выделения тех вирусов, которые плохо репродуцируются в культуре или эмбрионе. К его недостаткам относятся контаминация организма подопытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры клеток для получения чистой линии данного вируса, что удлиняет сроки исследования.

 

Бактериофаги

Все бактериофаги классифицируются по типу содержания в них нуклеиновой кислоты. По специфичности различают типовые, видовые и поливалентные.

Отличие бактериофагов от прокариотов:

­ бактериофаги содержат только одну из нуклеиновых кислот ДНК или РНК;

­ не имеют клеточного строения;

­ не способны к делению мейозом и бинарному делению;

­ не имеют собственных метаболических систем;

­ воспроизводятся за счет одной нуклеиновой кислоты, а не за счет своих собственных составных частей.

Выявление бактериофагов.

1) методом прямой фильтрации

2) методом Фюрта

3) методом Отто

В основе всех методов положен феномен бактериофагии дЭррелля для проявления, которого исследуемый материал засевают совместно с гомологичной культурой микроорганизмов на плотные и жидкие питательные среды. Культуры микроорганизмов, чувствительные к выделенному фагу, называют тест-культурами.

Титрование бактериофагов осуществляется:

­ на жидких питательных средах по Аппельману;

­ на плотных питательных средах по Грации.

Применение бактериофагов

1) фагопрофилактика проводится для предупреждения некоторых заболеваний (например, дизентерии) среди лиц, находящихся в эпидемическом очаге;

2) фагодиагностика заключается в выделении фага из организма больного (например, из испражнений), что косвенно свидетельствует о наличии в материале соответствующих микроорганизмов;

3) фаготерапия – лечение некоторых инфекционных заболеваний, вызванных, например шигеллами, протеем, стафилококком.