Методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий.

Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:

1-й день - микроскопия мазка из исследуемого материала, ок­рашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева. Затем посев материала на поверхность застывшего пита­тельного агара для получения изолированных колоний. Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют остав­шуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на тре­тьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наи­меньшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изоли­рованные колонии.

Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на од­ной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из пер­вого сектора во второй и таким же образом последовательно в тре­тий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после су­точного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.

2-й день - изучение колоний, выросших на чашках, описание их. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными или непроз­рачными, они имеют различные размеры, округлые правильные или неправильные очертания, выпуклую или плоскую форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или волнистые, изрезанные края. Они могут быть бесцветными или иметь белый, золотистый, красный, желтый цвет. На основании изучения этих характеристик выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отби­рают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью проверки однородности микробов в колонии. Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным пита­тельным агаром.

3-й день - проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка. При однородности исследуемых бак­терий выделение чистой культуры можно считать законченным.

Для идентификации выделенных бактерий изучаются культуральные признаки, то есть характер роста на жидких и плотных пита­тельных средах. Например, стрептококки на сахарном бульоне образуют придонный и пристеночный осадок, на кровяном агаре - мелкие, точечные колонии; холерный вибрион образует пленку на поверхности щелочной пептонной воды, а на щелочном агаре - прозрачные коло­нии; палочка чумы на питательном агаре образует колонии в виде «кру­жевных платочков» с плотным центром и тонкими волнистыми края­ми, а в жидкой питательной среде - пленку на поверхности, а затем -нити, отходящие от нее в виде «сталактитов».

Выделение чистых культур анаэробных бактерий:

Химические методы заключаются в том, что чашки с посевами ана­эробов ставят в герметически закрытый эксикатор, куда помещают хи­мические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в чашках Пет­ри, герметически закрытых после посева. Вначале кислород погло­щается растущими аэробами, а затем начинается рост анаэробов.

Выделение чистой культуры анаэробов начинают с накопления анаэробных бактерий путем посева на среду Китта-Тароцци. В даль­нейшем получают изолированные колонии одним из двух способов:

1) посев материала производят путем смешивания с расплавленным теплым сахарным агаром в стеклянных трубках. После застывания ага­ра в глубине его вырастают изолированные колонии, которые извле­кают путем распила трубки и пересевают на среду Китта-Тароцци (спо­соб Вейнберга);

2) посев материала производят на чашки с питательной средой и инкубируют в анаэростате. Выросшие на чашке изолированные ко­лонии пересевают на среду Китта-Тароцци.

21) Вирусы (история открытия, характеристика).

Первооткрывателем вирусов, основоположником вирусологии яв­ляется русский ученый Дмитрий Иосифович Ивановский, открывший в 1892 году вирус табачной мозаики (ВТМ)

Вирусы настолько отличаются от микроорганизмов, что выделе­ны в особое царство - царство Vira

Особенности вирусов, отличающие их от всех других живых су­ществ:

1) наличие только одного типа нуклеиновой кислоты - ДНК или РНК, в то время как клетки всех остальных живых существ содержат ДНК и РНК, взаимодействие которых необходимо для биосинтеза бел­ков,

2) отсутствие собственных белоксинтезирующих систем и клеточ­ного строения;

3) внутриклеточный паразитизм на молекулярном (генетическом) уровне.

Внеклеточная форма вируса - вирион и вирус, находящийся внут­ри клетки хозяина - это две разные формы вируса.

Вирионы разных вирусов имеют размеры от 15 до 400 наномет­ров. Нанометр - это 10^{-9 метра. Наиболее мелкие вирусы - виру­сы полиомиелита - имеют вирион размером 17-25 им, средние - вирус гриппа - 80-120 нм, крупные - вирус оспы - 300-400 им.}

В центре вириона располагается его геном. Это нуклеиновая кис­лота - ДНК или РНК (однонитевая или двунитевая). Плюс-однонитевая РНК несет две функции: наследственную и информационную, напри­мер у вируса полиомиелита. Минус-однонитевая РНК, как, например, у вируса гриппа, несет только наследственную функцию, и только в процессе репродукции вируса к ней достраивается плюс-нить иРНК.

Вокруг нуклеиновой кислоты симметрично располагаются белко­вые молекулы - капсомеры, составляющие капсид (лат. capsa - коробка). Различают спиральный тип симметрии, когда капсомеры уложены по всей длине молекулы нуклеиновой кислоты, и кубический, когда кап­сомеры располагаются в виде двадцатигранника (икосаэдра).

Вирионы, содержащие только нуклеиновую кислоту и белок, сос­тавляют нуклеокапсид. Это простые вирусы, например, ВТМ, вирус полиомиелита.

У вирионов сложноорга-низованных вирусов имеется еще поверхностная оболочка - суперкапсид, содержащий, кроме белков, также углево­ды, липиды, компоненты клет­ки хозяина. Строение вирио­на лежит в основе классифи­кации вирусов. По типу нук­леиновой кислоты их делят на: рибовирусы и дезоксири-бовирусы, далее по структу­ре вирионов, по месту размно­жения и по другим признакам проводится деление на семей­ства и роды.

Вследствие малых разме­ров вирусы не видны в свето­вом микроскопе. Только наи­более крупный из них - вирус оспы - можно наблюдать в виде мелких точечных образо­ваний - элементарных телец Пашена.

Размножаясь в чувствительных клетках организма, вирусы оспы, бе­шенства, гриппа образуют в них внутриклеточные включения. Их мож­но обнаружить в световом или в люминесцентном микроскопе. Обна­ружение внутриклеточных включений используется для диагностики. Например, включения Бабеша-Негри в нервных клетках об­наруживаются при бешенстве.

Морфологию вирионов изучают в электронном микроскопе. Ви­русы имеют разные формы: сферическую, нитевидную, палочковидную.

Репродукция вирусов

Вирусы не способны размножаться на питательных средах - это строгие внутриклеточные паразиты. Более того, в отличие от риккетсий и хламидий, вирусы в клетке хозяина не растут и не размножаются путем деления. Составные части вируса - нуклеиновые кислоты и бел­ковые молекулы синтезируются в клетке хозяина раздельно, в разных частях клетки - в ядре и в цитоплазме. При этом клеточные белоксинтезирующие системы подчиняются вирусному геному, его НК.

Репродукция вируса в клетке происходит в несколько фаз:

- Первая фаза - адсорбция вируса на поверхности клетки, чувстви­тельной к данному вирусу.

- Вторая фаза - проникновение вируса в клетку хозяина путем виропексиса.

- Третья фаза - «раздевание» вирионов, освобождение нуклеи­новой кислоты вируса от суперкапсида и капсида. У ряда вирусов проникновение нуклеиновой кислоты в клетку происходит путем сли­яния оболочки вириона и клетки-хозяина. В этом случае вторая и тре­тья фазы объединяются в одну.

В зависимости от типа нуклеиновой кислоты этот процесс совер­шается следующим образом.

ДНК-содержащие (ДНК — > иРНК —>белок)

1. Репродукция происходит в ядрх: аденовирусы, герпес,папо-вавирусы. Используют ДНК-зависимую РНК - полимеразу клетки.

2. Репродукция происходит в цитоплазме: вирусы имеют свою ДНК-зависимую РНК полимеразу. РНК-содержащие.

1. Рибовирусы с позитивным геномом (плюс-нитиевые): пикорна-, тога-, коронавирусы. Транскрипции нет. РНК —>белок

2. Рибовирусы с негативным геномом (минус- нитиевые): грипп,корь, паротит, орто-, парамиксовирусы.

(-)РНК — > иРНК — > белок (иРНК комплементарная (-)РНК) Этот процесс идет при участии специального вирусного фермен­та - вирионная РНК-зависимая PHK-полимераза (в клетке такого фермента быть не может).

3. Ретровирусы

(-)РНК -> ДНК —> иРНК —>белок (и РНК гомологична РНК) В этом случае процесс образования ДНК на базе (-)РНК возмо­жен при участии фермента - РНК-зависимой ДНК-полимеразы (об­ратной транскриптазы или ревертазы)

- Четвертая фаза - синтез компонентов вириона. Нуклеиновая кис­лота вируса образуется путем репликации. На рибосомы клетки транс­лируется информация вирусной иРНК, и в них синтезируется вирус-специфический белок.

- Пятая фаза - сборка вириона. Путем самосборки образуются нуклеокапсиды.

- Шестая фаза - выход вирионов из клетки. Простые вирусы, на­пример, вирус полиомиелита, при выходе из клетки разрушают ее. Сложноорганизованные вирусы, например, вирус гриппа, выходят из клетки путем почкования. Внешняя оболочка вируса (суперкапсид) формируется в процессе выхода вируса из клетки. Клетка при таком процессе на какое-то время остается живой.

Описанные типы взаимодействия вируса с клеткой называются продуктивными, так как приводят к продукции зрелых вирионов.

Иной путь - интегративный - заключается в том, что после проник­новения вируса в клетку и "раздевания" вирус­ная нуклеиновая кисло­та интегрирует в клеточ­ный геном, то есть встраивается в опреде­ленном месте в хромосо­му клетки и затем в виде так называемого прови-руса реплицируется вме­сте с ней. Для ДНК- и РНК-содержащих виру­сов этот процесс совер­шается по-разному. В первом случае вирусная ДНК интегрирует в кле­точный геном. В случае РНК-содержащих виру­сов вначале происходит обратная транскрипция: на матрице вирусной РНК при участии фермента "обратной транскриптазы" образуется ДНК, которая встраи­вается в клеточный геном. Провирус несет дополнительную генетичес­кую информацию, поэтому клетка приобретает новые свойства. Виру­сы, способные осуществить такой тип взаимодействия с клеткой, на­зываются интегративными. К интегративным вирусам относятся неко­торые онкогенные вирусы, вирус гепатита В, вирус герпеса, вирус им­мунодефицита человека, умеренные бактериофаги.

Кроме обычных вирусов, существуют прионы - белковые инфек­ционные частицы, не содержащие нуклеиновую кислоту. Они имеют вид фибрилл, размером до 200 нм. Вызывают у человека и у животных медленные инфекции с поражением мозга: болезнь Крейтцфельда-Якоба, куру, скрепи и другие.