Молекулярно-генетические методы (полимеразная цепная реакция, днк-фингерпринтирование, метод гибридизации). Их значение в выявлении изменений в определенных участках генов и хромосом.

М-Г методы направлены на выявление изменений в определенных участках ДНК генов или хромосом.

 

1. ДНК-анализ.

 

- исходный материал – образцы ДНК, РНК. Источник – любые ядросодержащие клетки.

- Амплификация – увеличение копий фрагментов ДНК с помощью полимерзазной цепной реакции in vitro. Алгоритм ПЦР:

-- Получение исследуемого гена или участка ДНК: его вырезают из ДНК спец. Ферментами или синтезируют методом обратной транскипции (с и-РНК – ДНК)

-- Денатурация (разделение ДНК на 2 цепи)

-- отжиг (присоединение праймеров (РНК-затравок) к цепям ДНК)

-- Достраивание новых цепей ДНК с помощью ДНК-полимеразы.

Итого: образуется 2 цепи ДНК, служащие матрицей следующему циклу. Так синтезируют:

 

---ДНК-зонды (фрагменты ДНК помеченные радиоктивной или флоуресцентной меткой) и используют для определения характера повреждения в исследуемых последовательностей методом гибридизации. (смотрят, комплиментарен ому, что надо, он или нет)

 

Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ)

 

Во многих случаях достаточно исследовать небольшой фрагмент ген. Материала. Для выделения таких фрагментов используются ферменты – рестриктазы, которые режут ДНК на рестрикционные фрагменты в строго определенных местах. Для каждой рестриктазы существует специфический сайт узнавания (разрезания) и => набор полученных при ее действии фрагментов ДНК. Эти фрагменты могут быть рассортированы электрофорезом.

Если молекулы ДНК идентичны, они будут разрезаны на фрагменты одинаковой длины. Если в одной сайт рестрикции есть, а в другой нет – фрагменты будут различны. Такое бывает если:

-- Между сайтами рестрикци – мутация, меняящая длину нукл. Последовательности (выпадение, вставка)

-- Если там есть мутация, убирающая сайт рестрикции

-- Если аллели генов различны между сайтами рестрикции.

 

 

ДНК-фингерпринтирование

Основано на ПДРФ. Рестриктазы применяются в судебно-медицинской практике для получения ДНК-фингерпринтов (ДНК-«отпечатков пальцев»), чтобы установить идентичность ДНК. Основано на том, что в ДНК встречаются тандемно повторяющиеся короткие нуклеотидные фрагменты, колво длина и порядок которых уникальны для каждого человека.

 

Секвенирование по Сенглеру

Применяют для исследования ген материала, определения последовательности нуклеотидов ДНК. Так можно обнаружить любые типы мутаций. Самый общий подход секвинирования – метод обрыва цепи. Здесь одноцепочечная ДНК, последовательность которой исследуется, - матрица для серии комплиментарных цепей, обрывающихся в момент присоединения к цепи конкретного нуклеотида (1-4) получается серия фрагментов ДНК разной длины. Распологая их по длине путем электрофореза можно расшифровать состав ДНК.

 

Метод гибридизации –

Связывание двух одиночных сетей нуклеиновых кислот, ДНК или РНК, которые распознают друг друга, если комплиментарны. Чем больше сходство последовательностей нуклеотдидов, тем активнее образуются «гибридные» двуцепочечные молекулы.

(см ДНК-зонды)

 

Мутация гена, детерминирующего развитие гемофилии, произошла в клетках трофобласта. К каким последствиям это приведет?

Возможно я не права, но.

Мутация не затронула сам зародыш (клетки эмбриобласта) малыш родится здоровым, мутация не будет передаваться дальше по наследству.

Таким образом, если трофобласт не подвергнется какому-то повреждающему воздействию, то все пройдет нормально. Если же по какой-то причине там произойдет кровотечение, то будут проблемы, скорее всего выкидыш просто, зародыш погибнет, не закрепившись (трофобласт обеспечивает адгезию и погружение в стенку матки зародыша, потом делится на цито- и симпласто трофобласт (6 – 7 сутки)).

 

О каком способе заражения токсоплазмозом должен помнить врач акушер-г и неколог? На чем основана лабораторная диагностика токсоплазмоза? Какие виды животных включены в цикл развития паразита?

 

 

Токсоплазма – Toxoplasma gondii, возбудитель токсоплазмоза. Класс – споровики (sporozoa) зоонозное, природно-очаговое заболевание. Токсоплазма имеет форум полумесяца, больше ядро.

 

· Жизненный цикл (какие виды животных включены в цикл развития паразита)

Основные хозяева – кошачьи, промежуточные – человек, грызуны, (млекопитающие вообще), птицы, рептилии.

Основные хозяева заражаются, поедая мышевидных грызунов. Трофозоиды проникают в эпителиальные клетки пищеварительного тракта => шизогония с образованием мерозоитов. Часть мерозоидов => микро и макрогаметы. В результате слияния гамет (копуляции) => ооцисты (исинные цисты). Ооцисты выделяются с фекалиями во внешнюю среду, где при благоприятных условиях через 1-5 дней в ооцисте образуются 2 спороциты с 4 спорозитами. Те становятся инвазионными и могут сохранять жизнеспособность во внешней среде несколько лет.

Ооцисты со спорозоитами попадают в ПХ через рот (так чаще всего заражаются дети) в нижних отделах тонкого кишечника спорозоиты внедряются в эпителиальные клетки => трофозоиты, затем размножаются делением надвое. С током лимфы попадают в кровь, проникают в клетки печени, селезенки, миокарда и др. Размножаются интенсивно, скопление трофозоитов, покрытых клеточной мембраной => тканевая циста (псевдоциста) оболочка псевдоцисты может разрываться, трофозоиты, выходя из них, внедряться в сосдение клетки. В тканевых циста трофозоиты жизнеспособны десятки лет. При хронике могут покрываться доп соединиельнотканной оболочкой.

Такое же цистообразование, помимо полового роцесса, происходит и у ОХ. Так что инвазионной стадией может оказаться и трофозоит из тканевой цисты. В этом случае заражение ПХ (человека) может произойи алиментарным или контактно-бытовым путем от другого ПХ.

Итого, источники инвазии – кошки (ооцисты со спорозоитами) дикие\домашние животные, птицы, человек (тканевые цисты в слюне, сперме, нос. Слизи, околоплодных водах, молое), мясо животных. Алиментарный, контактный, аэрозольный (со слюной) механизмы.

 

· Акушер-гинеколог должен помнить

Что наиболее опасным является трансплацентарное заражение. При этом могут родиться дети с множественными врожденными патологиями развития, в первую очередь – головного мозга.

· При постановке диагноза

Используют методы иммунологическмх реакций, обнаружение токсоплазмы при прямом микроскопировании материала, взятого от больного человека, трупа. Для исследования используют плаценту, печень, кров, лимфоузны, головной мозг. + прменяют метоб биологических проб – лабораторным животным вводят кровь или спинномозговую жидкость больного. Мыши заболевают токсоплазмозом в острой форме и его легко у них обнаружить.

+++ бонус

Профилактика: термообрабока животных продуктов питания, санитарный контроль на бойнях и мясокомбинатах, предотвращение тесных контактов детей и беременных домашними животными.

 

Экзаменационный билет №32

Транскрипция: инициация, элонгация, терминация. Посттранскрипционные процессы. Процессинг мРНК. Сплайсинг первичных транскриптов мРНК. Регуляция инициации транскрипции эукариот. Индукция и репрессия генов.

Синтез первичного РНК транскрипта на матрице ДНК.

По матричной цепи ДНК РНК-полимераза движется от 3’-5’. Синтез цепи РНК от 5’ к 3’-концу, при этом матричная цепь ДНК всегда антипараллельна синтезируемой нуклеиновой кислоте.

Инициация: происходит на промоторе гена. На его полинуклеотидной последовательности образуется транскрибирующий комплекс из РНК-полимеразы и белков – общих факторов транскрипции (его белки помогают разрушать нуклеосомы, деспирализовать ДНК и определить сайт инициации).

Элонгация (рост цепи РНК): первый рибонуклеотид комплиментарно соединяется с нуклеотидом матричной цепи ДНК сайта инициации. РНК-полимераза присоединяет последующие рибонуклеотиды к 3’-OH-группе предыдущего нуклеотида с образованием 3’-5’-фосфодиэфирной связи.

Терминация: осуществляется в определенных участках матрицы – терминаторах. Фактор терминации облегчает отделение РНК-полимеразы от матрицы и первичного РНК-транскрипта, комплиментарно матрице.

Посттранскрипционные процессы.

У прокариот только кодирующие аминокислоты полинуклеотидной последовательности.

У эукариот экзоны и интроны, поэтому транскрипты РНК подвергаются ряду модификаций (процессинг мРНК), а именно:

1) Кэпирование – присоединение на 5’-конце незрелой мРНК. Кэп необходим для осуществления сплайсинга и транспортирования мРНК в цитоплазму и для узнавания мРНК малой субъединицей рибосомы.

2) Полиаденилирование – на 3’-конец присоединяется полиА-«хвост» (100-200 остатков адениловой кислоты), это облегчает выход мРНК из ядра и замедляет ее гидролиз в цитоплазме.

3) Сплайсинг первичных транскриптов мРНК – вырезание из незрелой мРНК интронов и сшивание между собой экзонов, происходит в ядре, в цитоплазму уже зрела мРНК. Катализируется сплайсосомой (нуклеопротеидный комплекс, из белков и мяРНК).

У эукариот гены имеют собственные промоторы и могут синтезироваться по отдельности.

Экспрессия генов может регулироваться на разных этапах, основной – транскрипция.

Необходимо присоединение специфических факторов транскрипции.

С энхансерами связываются белки-активаторы. Репрессоры могут связываться с сайленсерами, оказывающие ослабляющее действие.

Основные способы посттрансляционной регуляции – альтернативный сплайсинг и изменение стабильности РНК.

Альтернативный сплайсинг. В ходе него экзоны первичного РНК-транскрипта объединяются в различные комбинации (разные формы зрелой мРНК). Один ген может экспрессировать несколько мРНК.

Регулирующим методом также может являться скорость разрушения мРНК.

Время полужизни мРНК в клетках прокариот несколько минут. Когда нет кэпа ферменты быстро разрушают молекулу.