Молекулярно-генетических методы (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов, секвенирование по сэнгеру) . Их значение в выявлении изменений в определенных участках днк генов или хромосом

 

Метод полиморфизма длины рестрикционных фрагментов

Значительное число нуклеотидных замен приводит к появлению в последовательности ДНК новых сайтов для различных рестриктаз. В результате нормальный фрагмент ДНК и фрагмент с заменой нуклеотида будут разрезаться одной рестриктазой на разное число фрагментов, отличающихся по длине. Различной длины фрагменты легко выявляются при помощи электрофореза.

Примером может служить рестрикционный анализ фрагмента гена алькогольдегидрогеназы (ADH). После ПЦР образуется фрагмент 165 н.п. АллельADH-1 не несет замены, после его обработки рестриктазойMaeIIIпри электрофорезе выявляются 2 фрагмента (98 и 68 н.п.). АллельADH-2 несет нуклеотидную замену (при замене образуется лишний сайт для рестриктазы) и после рестрикции разрезается на 3 фрагмента (63, 36 и 68 н.п.).

Секвенирование ДНК

Секвенирование – определение нуклеотидной последовательности ДНК. Метод применяется для изучения генома человека как в норме так и в патологии. При помощи секвенирования определяют аллельные варианты генов, а также различные типы генных мутаций (чаще по замене оснований). Программа «Геном человека», результатом которой явилась расшифровка нуклеотидной последовательности генома человека (основная часть программы закончена в 2003г.) была осуществлена с применением методов секвенирования ДНК.

Существует несколько различных способов секвенирования ДНК. Первым был предложен химический метод Максама-Гилберта, затем ферментативный метод Сенгера. В настоящее время в основном применяется дидезоксинуклеотидный метод секвенирования ДНК (метод обрыва цепи).

В этой процедуре одноцепочечная молекула ДНК, последовательность которой определяется, служит матрицей для синтеза серии комплементарных цепей, обрывающихся в момент присоединения к растущей цепи специфических нуклеотидов. Для обрыва синтеза используют дидезоксинуклеотиды – искусственно синтезированные нуклеотиды, лишенные 2' и 3'- гидроксильных групп и поэтому не способные присоединять к цепи следующий нуклеотид. Проба ДНК делится на 4 пробирки, в которые добавляют праймер, ДНК-полимеразу, смесь четырех трифосфатов (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ) и небольшое количество одного из дидезокирибонуклеотидов (ддАТФ, ддГТФ, ддТТФ, ддЦТФ). Во время синтеза ДНК-полимераза случайным образом включает в цепь нормальные нуклеотиды и дидезоксинуклеотиды. При этом в каждой пробирке образуется набор фрагментов разной длины, заканчивающихся на один из дидезоксинуклеотидов.

После этого проводится электрофорез, что позволяет разделить отличающиеся на один нуклеотид фрагменты ДНК. В результате в геле образуется набор полос, напоминающих лестницу.

Нуклеотидная последовательность ДНК читается в геле снизу вверх, согласно направлению 5'-3' цепи ДНК.

Для определения нуклеотидной последовательности больших фрагментов ДНК используются автоматизированные машины (ДНК-секвенаторы).

Кроме перечисленных, применяется большое количество других молекулярных методов изучения последовательности человека.

3. Может ли в фенотипически женском организме обнаружиться У-хромосома.

Да, может. Это связано с аномалией формирования пола, называемой «тестикулярная феминизация». За формирование мужского пола у людей отвечает не только Y –хромосома, и но гормон тестестерон. Наличие в генотипе организма рецессивного гена X tt может повернуть развитие сформировавшегося организма в женскую сторону за счет дефицита тестестерона. В таком случае формируется фенотипическая женщина, характеризующаяся отсутствием вторичных половых мужских признаков.

 

4. При делении одного из бластомеров не произошло расхождения одной из 21-х хромосом. К чему это приведет?

Это в будущем может привести к геномной мутации, которая обусловит наличие лишней хромосомы. Это приведет к синдрому Дауна, который характеризуется отставанием в психическом и интеллектуальном развитии.

Если в некоторых бластомерах не произошло правильного расхождения хромосом и 21-я хромосома не разошлась, то у части клеток будет трисомия по 21-й хромосоме, т е синдром Дауна. Те клетки, у которых митоз происходил нормально во время дробления, дали клетки с нормальным кариотипом. Итак в результате нарушение кариотипа затрагивает только некоторые ткани и органы. Данный вариант развития синдрома Дауна называется «мозаичный синдром Дауна». Данная форма синдрома является, как правило, более лёгкой (в зависимости от обширности изменённых тканей и их расположения в организме), однако более трудна для пренатальной диагностики.

 

Экзаменационный билет №34

Мутационная изменчивость. Классификация, характеристика и биологическое значение мутаций. Примеры у человека.

Мутационная изменчивость – изменчивость, обусловленная действием на организм мутагенов (химических, физических и биологических), приводящая к возникновению мутаций.

Мутации бывают:

1 Генные – изменения последовательности нуклеотидов в пределах гена. Возникают в результате нарушения репликации, рекомбинации, репарации и затрагивают обе цепи ДНК. Они могут быть:

1) со сдвигом рамки считывания (выпадение или вставка одного или нескольких нуклеотидов)

2) без сдвига (поворот на 180̊ (инверсия) одного или нескольких нуклеотидов)

При генных мутациях изменения признака могут отсутствовать, возможно появление нового признака (в том числе и вредного или смертельного для организма), возникновение новых аллелей. Генные мутации обусловливают появление множественного аллелизма.

Примеры: фенилкетонурия, гемофилия, ахондроплазия, множественные аллелизм.

2 Хромосомные – изменения структуры хромосом, возникающие вследствие неравноценного кроссинговера или разрвов хромосом под действием мутагенов.

Виды:

Делеция – утрата участка хромосомы

Дефишенси – утрата концевого участка хромосомы

Дупликация – удвоение участка хромосомы

Инверсия – поворот участка хромосомы на 180 градусов

Транспозиция – смена места локализации участка хромосомы

Транслокация - перенос участка хромосомы на негомологичную хромосому. Отдельно выделяют реципрокные транслокации, при которых происходит взаимный обмен участками между хромосомами, и Робертсоновские транслокации, или центрические слияния, при которых происходит слияние акроцентрических хромосом с полной или частичной утратой материала коротких плеч.

Хромосомные перестройки приводят к образованию аномальных хромосом (кольцевых, дицентрические, с пробелом), происходит нарушение доз генов. Хромосомные перестройки возникают при неравноценном кроссинговере. При неравноценном внутригенном кроссинговере подобные изменения возникают на уровне нуклеотидов и приводят к возникновению генных мутаций.

Пример: синдром кошачьего крика – делеция короткого плеча пятой хромосомы.

3 Геномные – изменения числа хромосом в диплоидном наборе.

Полиплоидия – кариотип соответствует формуле kn, где n – гаплоидных набор хромосом, k>2. Пример: триплоидия (69 хромосом)

Гаплоидия - число хромосом в кариотипе n.

 

Анэуплоидия – изменение числа отдельных хромосом, при этом кариотип соответствует формуле 2n+-k,где2n–диплоидных набор хромосоми k неравно n.

Основной механизм возникновения этих мутаций – нарушение расхождения хромосом и хроматид при делении клеток.

Примеры:

Синдром Патау – трисомия в 13 хромосоме (47,XY+13) (проблемы с сердцем, со скелетом, идиотия, осложненная беременность)

Синдром Эдвардса – трисомия в 18 хромосоме (47, XY+18) (аномалии мозгового и лицевого черепа, скелета, пороки сердца)

Синдром Дауна – трисомия по 21 хромосоме (47, XY+21) (брахицефалия, мышечная гипотония, короткие конечности, плохо соображает и говорит)

Синдром Шерешевского-Тернера – моносомия по Х-хромосоме (45, ХО) (аномалии физического развития, низкорослостью и половым инфантилизмом)

Синдром трисомии Х (47, ХХХ) (могут возникнуть проблемы с координацией, моторикой и развитием речи)

Синдром Клайнфельтера – полисомия Х или Y при наличии Y хромосомы (47, XXY; 48, XXYY) (гинекомастия, длинные ноги, высокая талия)