Общие принципы сенсорной регуляции.

Все живые организмы нуждаются в информации об окружающей среде. Бактерии способны улавливать и определять малейшие изменения в окружающей среде. Эту возможность обеспечивают сенсорные (от лат. sensus — чувство, ощущение, восприятие) системы. Сенсорные системы бактерий похожи на подобные системы в клетках высших организмов.

Основными компонентами сенсорных систем являются:

· сенсоры (трансмембранные или цитоплазматические), детектирующие изменения окружающих условий;

· внутриклеточные посредники, получающие информацию от сенсоров и передающие ее на эффекторы;

· эффекторы - непосредственные регуляторы физиологического ответа (как правило, на уровне транскрипции).

У бактерий преобладают двухкомпонентные сенсорные системы, в них 2 белка регулируют передачу сигнала:

1-й белок сенсор;

2-й белок регулятор.

Белок-сенсор реагирует на изменения определенных параметров окружающей среды (напр., на концентрацию веществ), передаёт сигнал на белок-регулятор, который координирует поведение бактерий в зависимости от условий окружающей среды.

Механизм действия 2-ухкомпонентных сенсорных систем. После поступления сигнала извне на белок-сенсор он автофосфорилируеся. Воздействует на белок-регулятор, в котором при этом фосфорилируется аспарагиновый участок. После фосфорилирования белок-регулятор действует на определенные участки генома, регулируя активность определенных генов. Белок-регулятор может выступать в роли активатора, а также в роли репрессора.

 

 

47.. Передача информации через клеточную мембрану.

Важное свойство мембран - способность воспринимать и передавать внутрь клетки сигналы из внешней среды. "Узнавание" сигнальных молекул осуществляется с помощью белков-рецепторов, встроенных в клеточную мембрану клеток-мишеней или находящихся в клетке. Клетку-мишень определяют по способности избирательно связывать данную сигнальную молекулу с помощью рецептора.

Если сигнал воспринимается мембранными рецепторами, то схему передачи информации можно представить так:

• взаимодействие рецептора с сигнальной молекулой (первичным посредником);
• активация мембранного фермента, ответственного за образование вторичного посредника;
• образование вторичного посредника цАМФ, цГМФ, ИФ3, ДАТ или Са²⁺;
• активация посредниками специфических белков, в основном протеинкиназ, которые, в свою очередь, фосфорилируя ферменты, оказьюают влияние на активность внутриклеточных процессов.

Несмотря на огромное разнообразие сигнальных молекул, рецепторов и процессов, которые они регулируют, существует всего несколько механизмов трансмембранной передачи информации: с использованием аденилатциклазной системы, инозитолфосфатной системы, каталитических рецепторов, цитоплазматических или ядерных рецепторов.

48. Белковые каналы, транспортеры и рецепторы. Рецепторная функция воротных каналов.
Воротный механизм белковых каналов обеспечивает способ регуляции ионной проницаемости каналов. Полагают, что некоторые ворота фактически являются удлинением транспортной белковой молекулы, которое может закрывать или открывать отверстие канала при кон-формационном изменении формы самой белковой молекулы. Открытие и закрытие ворот регулируется двумя основными способами. Электроуправляемые ворота. В этом случае молекулярная конформация ворот или их химических связей соответствует электрическому потенциалу на клеточной мембране. Напротив, когда внутренняя сторона мембраны теряет отрицательный заряд, эти ворота могут внезапно открываться, позволяя громадному числу ионов натрия проходить через натриевые поры. Это основной механизм генерации в нервах потенциалов действия, ответственных за проведение нервных сигналов.Открытие этих ворот частично обусловливает завершение потенциала действия. 2. Хемоуправляемые (лигандуправляемые) ворота. Некоторые ворота белковых каналов открываются при связывании с белком химического вещества лиганда. Это ведет к конформационному или химическому изменению в белковой молекуле, что открывает или закрывает ворота. Такой воротный механизм называют химическим, или лигандным. Одним из наиболее важных примеров химического воротного механизма является действие ацетилхолина на так называемый ацетилхолиновый канал. Ацетилхолин открывает ворота этого канала, в результате появляется отрицательно заряженная пора диаметром около 0,65 нм, через которую могут проходить незаряженные молекулы или положительные ионы меньшего диаметра. Эти ворота исключительно важны для передачи нервных сигналов от одной нервной клетки к другой и от нервных клеток к мышечным, что необходимо для мышечного сокращения. Открытое и закрытое состояние воротных каналов. Примечательно, что канал проводит ток по принципу «все или ничего». Это значит, что ворота канала резко открываются и затем также резко закрываются, причем в открытом состоянии канал находится от долей миллисекунды до нескольких миллисекунд. При одном уровне потенциала канал может оставаться практически все время закрытым, а при другом уровне — почти все время открытым. Как показано при промежуточных уровнях мембранного потенциала ворота натриевого канала имеют склонность периодически быстро открываться и закрываться, обеспечивая среднее значение тока. Метод «пэтч-кламп» для регистрации ионного тока, протекающего через одиночные каналы. Показанную на рис. 4-5А регистрацию ионного тока, протекающего через одиночные белковые каналы, технически осуществляют с помощью метода «пэтч-кламп». Микропипетку с диаметром кончика не более 1-2 мкм подводят вплотную к мембране с наружной стороны. Затем изнутри пипетки создают отрицательное давление, благодаря чему расположенный напротив участок мембраны подсасывается к кончику пипетки, формируя плотный контакт с его краями. В результате можно регистрировать электрический ток, протекающий через очень маленький кусочек («пэтч») мембраны у верхушки пипетки. Кроме того маленький кусочек клеточной мембраны на конце пипетки можно вырвать из клетки. Затем пипетку с герметически сцепленным с ней кусочком помещают в любой раствор. Это позволяет, по желанию экспериментатора, изменять состав раствора как внутри пипетки, так и снаружи, а также поддерживать на любом заданном уровне разность потенциалов между двумя сторонами мембраны, т.е. фиксировать («кламп») напряжение. Можно выделить такой малый участок мембраны, что в нем обнаруживается лишь один белковый канал, доступный для изучения. Путем изменения концентраций разных ионов и напряжения по обе стороны мембраны можно определять транспортные характеристики одиночного канала и свойства его воротных механизмов.

 

49. Двухкомпонентные сенсорные системы
Типичная двухкомпонентная система состоит из двух белков –гистидиновой протеинкиназы (ГК), содержащей консервативный киназный домен и регулятора ответа (РО), содержащего консервативный регуляторный домен. Внеклеточные сигналы детектируются ГК, что приводит к изменению ее активности. Затем ГК передает фосфогруппу на РО (реакцию катализирует сам РО). Перенос фосфата на РО

приводит к активации эффекторного домена этого белка, что и вызывает в конечном итоге специфический физиологический ответ. В основе работы двухкомпонентной системы лежат три реакции, дающие два фосфорилированных продукта. Хоть ГК и похожи по своей основной функции (фосфорилирование белков) на "классические" Ser/Thr/Tyr киназы, химизм реакции принципиально отличается – ГК образует не фосфоэфирную, а фосфоамидную связь. Реакция гидролиза фосфоамидной связи имеет гораздо большее отрицательное значение ∆G по сравнению с гидролизом фосфоэфирной связи, поэтому равновесие р-и сдвинуто в

сторону нефосфорилированного белка ГК. Следовательно, только очень небольшой процент ГК существует в фосфорилированном виде => не фосфорилирование ГК как таковое, а перенос фосфата является основным в работе этого фермента. Богатая энергией связь N~P идеально подходит для

передачи фосфата. Именно поэтому такая же связь используется хорошо знакомыми вам ферментами I и II ФТС, основной функцией которых является также не фосфорилирование как таковое, а передача фосфата "по цепочке" в направлении его конечного акцептора – фосфорилируемого сахара. В молекуле РО фосфорилируется остаток аспартата. Предположительно, именно этот остаток используется, т.к. фосфорилирование его длинной ацильной цепи вызывает протяженные

конформационные изменения в молекуле РО, необходимые для изменения эффекторной активности. Еще одним важным свойством фасфоаспартата является быстрый гидролиз ацилфосфата как в кислой, так и в щелочной среде. К тому же, многие РО имеют автофосфатазную активность, еще более

уменьшающую время полужизни фосфоаспартата. Таким образом, основным результатом выбора для фосфорилирования специфических остатков в

молекулах ГК и РО является высокая мобильность системы. При отсутствии стимула оба компонента будут дефосфорилированы. Детекция стимула гистидинкиназой вызовет ее фосфорилирование и очень быструю передачу фосфата молекуле регулятора ответа, что приведет к быстрому ответу бактерии на изменившиеся условия. В свою очередь, легкость дефосфорилирования молекулы РО приведет к быстрому возвращению всей регуляторной системы, а вместе с ней и метаболизма бактериальной

клетки, в исходное (нефосфорилированное) состояние при исчезновении стимула, вызвавшего первоначальное фосфорилирование ГК.

50. Регуляторы:

Регуляторный домен.

Наиболее консервативная часть белка, содержит кластер остатков аспартата, которые связывают Mg2+ и формируют активный сайт для переноса фосфата

Эффекторный домен

Эффекторным доменам сложно дать общую характеристику по причине их большогоразнообразия. Большинство эффекторных доменов имеет ДНК-связывающую активность и действиет путем активации или репрессии транскрипции специфических генов. Тем не менее, узнаваемые

последовательности ДНК, расположение сайтов связывания и механизм транскрипционной регуляции существенно различаются, даже у РО из одного подсемейства.

Сенсоры:

Линкерный домен

У трансмембранных ГК периплазматический сенсорный домен соединяется с цитоплазматическим киназным ядром при помощи трансмембранной α-спирали и цитоплазматического линкера. Линкерные домены совершенно необходимы для нормального функционирования сенсорных ГК, однако об их функциях известно немного. Размер линкеров варьирует в пределах 40-180 АК. Многие из них имеют характерный α-спиральный coiled coil мотив, в большинстве случаев предшествующий фосфорилируемому гистидиновому остатку киназного ядра. Две наиболее вероятные функции линкерных доменов – правильное расположение мономеров в димере ГК и передача сигнала от сенсорной к киназной части белка.

Каталитическое киназное ядро.

Унифицирующим структурным свойством семейства ГК является характерное киназное ядро, состоящее из домена димеризации и АТФ/АДФ-связывающего фосфотрансферного или каталитического домена.

Киназное ядро имеет размер ~350 АК и отвечает за связывание АТФ и осуществление киназной реакции. Консервативный остаток гистидина, являющийся субстратом киназной реакции, располагается в домене димеризации.

HPt-домены у прокариот встречаются исключительно в составе гибридных киназ, тогда как у эукариот – как отдельные белки. Эти домены имеют размер около 120 АК и содержат остаток гистидина, способный

участвовать в фосфотрансферных реакциях. HPt-домены не имеют ни киназной, ни фосфатазной активности, поэтому они идеально приспособлены для коммуникации между различными белками. При всем разнообразии первичных последовательностей HPt-доменов их третичная структура очень схожа и напоминает таковую домена димеризации киназного ядра, включая

расположение консервативного гистидинового остатка.

Сенсорный домен

Изменения в окружающей среде детектируются непесредственно (или опосредованно) аминоконцевым сенсорным доменом ГК. Между разнообразными мембранными сенсорными доменами практически полностью отсутствует сходство на уровне первичной последовательности, что поддерживает идею о специфичности детектируемых ими взаимодействий. В большинстве случаев специфический стимул и механизм его детекции остаются неизвестными. Информация о трехмерной структуре этих доменов начинает появляться только сейчас, поэтому как сигнал передается к киназному ядру, пока не ясно.

51. Архитектура регуляторных систем
Элегантность двухкомпонентных систем заключается в их модулярности. Простейшая сигнальная система может состоять из одной пары ГК(гистидиновая протеинкиназа)-РО(регулятор ответа). В более сложных случаях домены, входящие в состав ГК и РО, а также HPt-домены могут комбинироваться, образуя уже сигнальную цепочку или даже сеть, известную под названием фосфотрансляционная система (система передачи фосфата). Классические двухкомпонентные системы доминируют у прокариот, тогда как фосфотрансляционные системы чаще встречаются у эукариот (хотя прокариотические примеры тоже имеются). Дополнительная сложность фосфотрансляционных систем позволяет ввести дополнительные стадии контроля а также возможность взаимодействия между различными сигнальными путями. Большинство регуляторных систем устроены просто. Трансмембранная сенсорная ГК посредством одной реакции передачи фосфата активирует цитоплазматический РО, который вызывает

соответствующий адаптивный ответ. Фосфотрансляционные системы

Еще более усложненные версии двухкомпонентных систем используют более одного акта передачи фосфата. Такие сигнальные пути называют фосфотрансляционными системами (системами передачи фосфата). В простейшем случае фосфотрансляционная система удлиняет цепочку передачи фосфата на два шага, Asp -> His и His -> Asp. Таким образом, базовая фосфотрансляционная система имеет уже четыре фосфорилированных белковых продукта и пять реакций переноса фосфата.

Множественные фосфорилируемые домены фосфотрансляционных систем создают возможность альтернативных путей передачи фосфата. В гибридной ГК ArcB любой из имеющихся His-содержащих доменов (димеризационный или же HPt) может получить фосфат от АТФ и передать его РО ArcA. Два

различных варианта используются в аэробных и анаэробных условиях.

Еще более сложная организация может достигаться за счет интеграции различных сигнальных цепочек в сигнальные сети. У B. subtilis практически каждая двухкомпонентная система взаимодействует с как минимум еще одной цепочкой передачи фосфата. В качестве примера такой

интеграции можно привести взаимодействие путей, контролирующих утилизацию фосфата аэробного и анаэробного дыхания и споруляцию. Дыхание и утилизация фосфата регулируются совместно – фосфо-PhoP активирует экспрессию ResD и наоборот. Однако, когда клетка вступает на путь споруляции, и дыхание, и утилизация фосфата репрессируются,

поскольку фосфо-Spo0A негативно регулирует фосфорилированные ResD и PhoP.