Роль контролируемого протеолиза в регуляции метаболизма у про- и эукариот.

Протеолиз (проте [ины] + lysis разложение, распад) — ферментативный гидролиз белков и пептидов, катализируется протеолитическими ферментами (пептид-гидролазами, протеазами) и играет важную роль в регуляции обмена веществ в организме.

Протеолитические ферменты играют ключевую роль в жизненном цикле клеток всех организмов, представляющих три основных эволюционных клеточных домена жизни - бактерии, эукариоты и археи.

Клетки эукариот содержат широкий спектр различных протеиназ, локализованных практически во всех структурных компанентах клетки и цитоплазме. Цитоплазматические долгоживущие белки, переносятся эукариотическими клетками для деградации в лизосомы, а короткоживущие цитоплазматические белки подвергаются деградации цитоплазматическими протеолитическими системами. Таким образом, в клетках эукариот интенсивная протеолитическая деградация белков

и пептидов осуществляется как в лизосомах, так и в цитоплазме. Деградации белков в лизосомах. Лизосомы являются классическим компартментомпротеолиза, они содержат множество неспецифических протеиназ различного типа. Во внутриклеточные процессы деградации белков в значительнойстепени вовлечены цистеиновые протеиназы, а также аспартатные, сериновые, металлопротеиназы иих ингибиторы. Лизосомы, которые находят почтиво всех клетках эукариот, крайне гетерогенны. Существует множество путей, которыми внутриклеточные белки могут доставляться в лизосомы для последующего протеолиза. Микро- и макроаутофагии не проявляют селективности и различные белки, как и другие субстраты, захватываются и доставляются в лизосомы с одинаковой скоростью. Эндоцитоз, напротив, высоко селективен как в интернализации белков плазматических мембран, так в последующем попадании их в лизосомы. Путь импорта белков с участием АТФ для протеолиза в лизосомах также высокоселективен и поставляет только цитозольные белки, содержащие пептидный мотив, который биохимически родственен следующей последовательности аминокислот Lys-Phe-Glu-Arg-Gln. Деградация белков в цитоплазме. В отличии от лизосом цитоплазма содержит протеиназы, высокоспецифичные по отношению кбелкам, которые отбираются в клетке для деградации. Открыты пути деградации белков, в которых в различных комбинациях принимают участие олигопептид убиквитин и убиквитиновая система, способная узнавать и метить белки, подлежащие деградации, АТФ и полиферментный комплекс, называемый протеасомой, который кроме нескольких типов протеолитической активности обладает еще и АТФ-азной активностью, а также шапероны, специфические белки, контролирующие свертывание (фолдинг) полипептидных цепей, их миграцию и протеолиз. Изменение скоростей синтеза и распада белков может играть решающую роль в адаптационных процессах, связанных с дифференцировкой, ростом, гормональными эффектами, питанием, атрофией и болезнями.

Прокариоты. Внутриклеточный селективный гидролиз белков, направленный на поддержание низкого базального уровня регуляторных белков и быстрое удаление мутантных, поврежденных и других опасных для клетки белков, выполняется специфическими ферментами - АТР-зависимыми протеиназами. Они объединяют в своей структуре АТРазные и протеолитические компоненты и относятся к выявленному в 1990-х гг. суперсемейству ААА+-белков. Исторически первой обнаруженной энергозависимой протеиназой явилась Lon-протеиназа Escherichia coli. К настоящему времени в бактериальных клетках выявлено четыре группы АТР-зависимых протеиназ: Lon (подсемейство LonA), FtsH, ClpAP/XP и HslUV/CodWX.

 

43. Межклеточные коммуникации.

Есть данные о том, что «бактерии, как и все живые организмы, в процессе жизнедеятельности получают, обрабатывают и используют информацию об окружающем мире… Обмен информацией или ее получение от других живых объектов называется коммуникацией» Микроорганизмы, и в их числе бактерии, используют следующие каналы коммуникации:

Контактная коммуникация предполагает наличие межклеточных контактов различных типов – цитоплазматических мостиков (плазмодесм), участков слияния наружных мембран (у грамотрицательных бактерий) или пептидогликановых клеточных стенок (у грамположительных бактерий). Контактная коммуникация между клетками микобактерий Myxococcus xanthus необходима для реализации поздних стадий формирования плодовых тел. Межклеточные контакты формируются за счет многообразных поверхностных структур, включая микрофибриллы, шишковидные выступы, гликокаликс(клеточная оболочка).

Дистантная химическая коммуникация между пространственно разделенными клетками. Многие из участвующих в дистантной химической коммуникации веществ отвечают за координацию в масштабах колонии (биопленки) процессов роста и развития клеток. Такие сигнальные вещества обозначаются в литературе как ауторегуляторные вещества, или ауторегуляторы и определяются как “микробные метаболиты, выделяемые всей популяцией клеток или ее частью в окружающую среду, играющие важную сигнальную роль и влияющие на физиологическое состояние и репродуктивные способности организмов». Так, установлено, что в период лаг-фазы и экспоненциальной фазы роста культура E. coli выделяет в среду вещества, стимулирующие рост другой культуры E. coli (аутостимуляторы), а в период замедления роста и в стационарную фазу – вещества, ингибирующие рост другой культуры этой бактерии (аутоингибиторы).

Детально изучены так называемые кворум-зависимые (quorum-sensing, QS) системы, ставящие под контроль плотности микробной популяции (кворума), оцениваемой по концентрации вырабатываемых всеми клетками популяции сигнальных веществ – феромонов (или аутоиндукторов), многие важные процессы. К этим процессам относятся: люминесценция, синтез антибиотиков и ферментных комплексов, межклеточный перенос генетической информации (трансформация, конъюгация), клеточная агрегация, секреция белков, формирование биоплёнок, споруляция, образование факторов вирулентности и др. «Бактерии образуют малые, легко диффундирующие молекулы, называемые аутоиндукторами, и когда эти сигнальные вещества достигают критической концентрации, соответствующие QS-системы активируются или репрессируются. У некоторых, но не у всех объектов, сами QS-системы регулируются по принципу положительной обратной связи (аутоиндукция)».

Так, у грамотрицательных бактерий в большинстве кворум-зависимых систем аутоиндукторами (феромонами) служат ацилированные гомосеринлактоны(АГЛ). Эти вещества связываются c R-белками, и полученный комплекс активирует транскрипцию генов, отвечающих за кворум-зависимые процессы. Если плотность бактериальных клеток достаточно высокая, то бактерии предпринимают те или иные коллективные действия. Например, морские бактерии Vibrio fischeri и V. harveyi начинают светиться.

У грамположительных бактерий распространены quorum-sensing системы, в которых роль феромонов (аутоиндукторов) играют пептиды, которые могут быть линейными или включать в себя тиолактоновое кольцо. Эти QS-системы являются двухкопонентными: содержат сенсорную гистидиновую киназу, которая в ответ на связывания феромона фосфорилирует второй компонент системы – белковый регулятор ответа. Запускается каскад киназ, в конечном счете фосфорилирующий и тем самым активирующий белок, который индуцирует транскрипцию определенного оперона ДНК.

Многие из изученных бактерий одновременно содержат несколько QS-систем. QS-системы вступают в разнообразные взаимоотношения между собой. Они могут функционировать параллельно или последовательно, могут конкурировать или противодействовать друг другу.

Дистантная физическая коммуникация. В дистантной передаче информации между клетками бактерий предполагается участие электромагнитных и звуковых волн разных диапазонов. Еще в 20-30-е годы ХХ века изучали «митогенетические лучи» (ультрафиолетовое излучение), кванты которого испускаются живыми клетками и стимулируют деление других клеток, в том числе и бактериальных. При изучении этих процессов одни предполагали вклад электромагнитных волн разных диапазонов, другие - роль ультразвуковых волн. В последующих изучениях было продемонстрировано синергидное (взаимоусиливающее) действие различных каналов межклеточной коммуникации, а именно химических сигналов и физических полей.

 

 

44. Регуляция синтеза экзоферментов и антибиотиков у Erwinia.

Фитопатогенные бактерии Erwinia carotovora продуцируют довольно широкий спектр гидролитических ферментов, деградирующих клеточные стенки растений. К таким ферментам относятся пектатлиазы, целлюлазы, полигалактуроназы и протеазы. Развитие этого патогена в растениях ведет к индукции этих ферментов, результатом чего является мацерация растительных тканей и развитие симптомов мягкой гнили. Продукция внеклеточных ферментов зависит от накопления N-3-оксогексаноил-L-гомосерин лактона, синтез которого детерминируется гомологами LuxI, которые у разных штаммов называются ExpI, CarI и HslI. Рядом с геном expI находится expR - гомолог luxR. Мутанты по гену expI имеют сниженную, а по гену expR – повышенную продукцию экзоферментов.

Кроме того, некоторые штаммы Erwinia carotovora продуцируют β-лактамные антибиотики широкого спектра действия - карбапенемы. Синтез карбапенемов координирован с экспрессией экзоферментов и может служить для ингибирования других бактерий при конкуренции за питательные вещества, высвобождающиеся при мацерации растительных тканей. Синтез карбапенемов контролируется парой белков CarR и CarI, гомологичных, но не идентичных по своим функциям ExpR и ExpI. CarR и ExpR не взаимозаменяемы, но АГСЛ (ацилированный гомосеринлактон), продуцируемый CarI, идентичен таковому ExpI. Продукция экзоферментов у Erwinia контролируется дополнительно еще несколькими регуляторными системами.

 

 

Сенсорные системы

 

Для бактерий (как, впрочем, и для любого другого организма) способность координировать экспрессию генов с изменениями условий окружающей среды дает существенное селективное преимущество. Адаптация бактерий к изменяющимся условиям среды контролируется белковыми системами передачи сигнала. Такие системы состоят из белковых модулей-доменов, собранных в несколько молекул, количество которых варьирует в зависимости от вида бактерии и конкретного фактора среды. Основными компонентами сенсорных систем являются:

· сенсоры (трансмембранные или цитоплазматические), детектирующие изменения окружающих условий;

· внутриклеточные посредники, получающие информацию от сенсоров и передающие ее на эффекторы;

· эффекторы - непосредственные регуляторы физиологического ответа (как правило, на уровне транскрипции).

Трансмембранные рецепторы.

Механизм детекции сигнала не совсем ясен. Детектируемый сигнал может быть как вне-, так и внутриклеточным. В некоторых случаях показано, что сигнал детектируется периплазматическим доменом. Так, PhoQ - регулятор экспрессии факторов вирулентности у Salmonella typhimurium, - является сенсором дивалентных катионов, которые, связываясь непосредственно с периплазматическим доменом, стабилизируют неактивную конформацию PhoQ. Сигнал может быть внутриклеточным. Рецептор Aer, участвующий в регуляции аэротаксиса, детектирует внутриклеточный запас энергии, связываясь с FAD. Еще один пример – детекция внутриклеточной концентрации глутамина при регуляции азотного метаболизма. В ряде случаев показано, что сенсором является трансмембранный домен. Так, Cpx-путь активирован у мутантов E. coli, лишенных фосфатидилэтаноламина - таким образом, простое нарушение мембранной структуры приводит к активации этого сигнального пути. У белка EnvZ E. coli - гистидинкиназы, участвующей в осморегуляции, периплазматический домен может быть делетирован без потери сенсорной функции.

Механизм передачи сигнала.

Многие бактериальные рецепторы имеют периплазматический домен-детектор (P) и

цитоплазматический сигнальный домен (C), заякоренные в мембране двумя α-спиральными трансмембранными сегментами. Линейная структура таких белков может быть представлена как TM1–P–TM2–L–C, где L - цитоплазматический линкер. Сигнальный домен либо сам является гистидинкиназой (EnvZ) либо с гистидинкиназой

взаимодействует (MCP рецепторы хемотаксиса).

Механизм передачи сигнала с сенсорного на сигнальный домен неясен. Рецепторы обычно являются мембранными белками, гомодимерами. Предполагалось, что конформационные изменения, возникающие при связывании субстрата, передаются через мембрану на цитоплазматические домены рецептора, что влияет на взаимодействие сигнальных доменов между собой. Однако делеция одного из двух сигнальных доменов (равно как и удаление всех трансмембранных сегментов) у димера не лишает его активности.

Двухкомпонентная система состоит из двух белков –гистидиновой протеинкиназы

(ГК), содержащей консервативный киназный домен и регулятора ответа (РО), содержащего консервативный регуляторный домен.

Внеклеточные сигналы детектируются ГК, что приводит к изменению ее активности.

Затем ГК передает фосфогруппу на РО (реакцию катализирует сам РО). Перенос фосфата на РО приводит к активации эффекторного домена этого белка, что и вызывает в конечном итоге специфический физиологический ответ.