Промоторы эукариот: размеры, положение, структура и механизм распознавания различными РНК-полимеразами.

В соответствии с биохимическими критериями промотор представляет собой последовательность нуклеотидов, обеспечивающую базальный (но не максимальный) уровень транскрипции соответствующего транскриптона. Он является той минимальной последовательностью, которая специфически распознается холоферментом РНК-полимеразы среди случайных последовательностей нуклеотидов.

Бактериальный промотор содержит две канонические последовательности: в области -35 и в области -10.

Промотор эукариотических генов, узнающийся РНК-полимеразой промотор содержит два базовых регуляторных элемента: ТАТА-последовательность (положение -25) и специфическую нуклеотидную последовательность, обогащенную пиримидинами в положении -75.

Основной элемент промотора - место связывания РНК-полимеразы, которое она занимает перед началом синтеза РНК. В состав промоторов могут входить также участки связывания белков-регуляторов.

У эукариот регуляторные элементы собраны в регуляторные регионы. Основной регуляторный элемент эукариот – это коровый (базальный) промотор. Он обеспечивает сборку базального транскрипционного комплекса (из основных факторов транскрипции и РНК-полимеразы) и инициацию транскрипции на базальном (исходном, базовом) уровне. Часто этот уровень так низок, что приводит к синтезу лишь единичных молекул РНК и, в дальнейшем, белков.

 

Промоторные элементы, контролирующие точку инициации и интенсивность транскрипции.

Промоторы, узнаваемые РНК-полимеразой II, содержат три различных семейства регуляторных последовательностей ДНК. Последовательности первого семейства включают так называемые коровые, или базальные элементы промотора, расположен­ные вблизи точки инициации транскрипции. В настоящее время известны два класса базальных элементов: TATA-последовательность, расположенная за 25–30 нуклеотидов до точки инициации (каноническая последовательность – TATAa/tAa/t), и так называемый инициатор (Inr), последовательность которого обогащена пиримидинами. Элементы TATA-последовательности и инициатор необходимы для сборки ДНК-белкового инициационного комплекса и распознаются основными факторами тран­скрипции. Промоторы РНК-полимеразы II содержат один или оба регуляторных элемента или же не имеют их вообще. При этом оба элемента могут функционировать независимо друг от друга или же в их действии наблюдается синергизм.

К двум другим классам цис- регуляторных промоторных элементов у эукариот относятся последовательности, расположен­ные вблизи промотора (от 50 до нескольких сотен пар оснований перед точкой инициации), а также дистальные элементы (эн­хансеры и сайленсеры), расстояние которых от промотора может превышать 60 т.п.о. Оба класса таких последовательностей со­держат сайты связывания регуляторных белков, модулирующих транскрипцию.

У некоторых промоторов, в частности ассоциированных с генами домашнего хозяйства, может отсутствовать явно выраженная TATA-последовательность. Проксимальные и дистальные регуляторные элементы промоторов построены из коротких транскрипционных элементов длиной в 10–15 п.о., с которыми непосредственно взаимодействуют фак­торы транскрипции. Проксимальные регуляторные элементы, как правило, имеют простую структуру, включающую один или не­сколько транскрипционных элементов (ТЭ).

 

 

Транскрипционный контроль

Регуляторная часть гена эукариот включает цис-регуляторные элементы (промотор, который граничит с открытой рамкой считы­вания гена) и транс- регуляторные элементы (энхансеры, сайленсеры, аттенюаторы и инсуля­торы) которые расположены далеко от кодирующей части гена (на расстоянии миллионов пар нуклеотидов).

В составе генов эукариот есть много регуляторных элементов. Для генов, которые экспрессируются конститутивно (то есть с постоянной скоростью), достаточно лишь наличие участков для связывания общих факторов транскрипции. Для генов, скорость экспрессии которых изменяется, существуют участки, связывающие регуляторные белки (специфические факторы транскрипции, репрессоры).
К активирующим элементам генома принадлежат: энхансеры (усилители транскрипции) – участки ДНК (мотивы, модули), кото­рые содержат несколько десятков пар нуклеотидов и расположены на значительном расстоянии от регулируемого ими гена, находясь спереди или сзади промотора, или в составе интронов. Связывание с энхансером соответствующих регуляторных бел­ков усиливает в десятки и сотни раз процесс транскрипции. Среди регуляторных последовательностей выделяют так называемые элементы ответа, то есть энхансеры, общие для группы генов. Благодаря, этому один гормон, связавшись с одним регуляторным белком, может активировать несколько генов.
Некоторые энхансеры после связывания с определенными белками не усиливают, а наоборот, блокируют транскрипцию генов, тогда они называются сайленсерами, или ослабляют транскрипцию, тогда они называются аттенюаторами. Они обеспечивают так называемое генетическое молчание, или сайленсинг. Благодаря сайленсингу организм может выключать из работы те гены, ко­торые ему на этом этапе не нужны. Это явление имеет место во время дифференциации клеток.
Известны также и инсуляторы или изоляторы - регуляторные элементы ДНК, которые отвечают за блокировку взаимодействия между энхансером и промотором. Действие инсулятора обеспечивается присоединением к нему специальных инсуляторных белков. Потребность в инсуляторе возникает тогда, когда активируется энхансер общий для группы генов, а активация одного гена из этой группы является нежелательной.

 

 

14. Стадии инициации транскрипции.

Инициация транскрипции — сложный процесс, зависящий от последовательности ДНК вблизи транскрибируемой после­довательности и от наличия или отсутствия различных белковых факторов.

Инициация транскрипции начинается со сборки на промоторе прединициационного комплекса, в состав которого входят молекулы РНК-полимеразы и матричной ДНК. Если в случае РНК-полимеразы E. coli и других прокариот для осуществления этого процесса нет необходимости в присутствии других белковых факторов, то механизм сборки инициационного комплекса с уча­стием РНК-полимеразы II носит более сложный характер. В настоящее время существуют две модели инициации транскрипции РНК-полимеразой II. В соответствии с одной из них на промоторе происходит постепенная (ступенчатая) сборка инициационного комплекса из отдельных компонентов. Другая модель акцентирует внимание на то, что Pol II может входить в состав инициаци­онного комплекса в виде холофермента, состоящего из многих субъединиц. Сборка такого комплекса начинается с последовательного связывания с промотором основных факторов транскрип­ции. Обычно факторами транскрипции называют белки или белковые комплексы, непосредственно не участвующие в каталитическом акте образования РНК, но необходимые для прохождения основных этапов транскрипции и ее регуляции. По функциональному признаку принято различать три класса факторов транскрипции. К первому классу относятся основные фак­торы транскрипции, обеспечивающие нерегулируемый базальный уровень транскрипции и функционирующие в клетках всех типов.

Ко второму классу относятся факторы транскрипции, специфически взаимодействующие с опре­деленными последовательностями ДНК, которые являются основ­ными регуляторами транскрип­ции и обеспечивают тканеспецифическую экспрессию генов. И, наконец, третий класс факторов 14транскрипции (в том числе много­численные TAF-белки (TAB-associated factors)) представлен недавно открытыми белками – коактиваторами транскрипции, которые действуют согласо­ванно с основными и тканеспецифическими факторами, обеспечивая более тонкую регуляцию транскрипции.