Распространенность двухкомпонентных систем

Двухкомпонентные сигнальные системы с участием фосфорилируемых остатков гистидина и аспартата наиболее часто встречаются у бактерий. Несмотря на обнаружение таких систем у эукариот, здесь в сигнальных цепях доминируют сигнальные каскады с переносом фосфата между остатками

серина, треонина и тирозина. С друкой стороны, Ser/Thr/Tyr киназы у прокариот тоже имеются. Пока нет удовлетворительного объяснения предпочтительному использованию той или иной системы у про- и эукариот. Количество генов, кодирующих белки двухкомпонентных систем, значительно варьирует в геномах различных организмов – от 0 у Mycoplasma genitalium до 2.5% генома у Synechocystis sp.

У эукариот пока описаны лишь единичные примеры ГК(гистидиновая протеинкиназа) и РО(регулятор ответа), однако у некоторых организмов их число больше – так, у слизевика Dictyostelium discoideum имеется как минимум 11 ГК. Кроме того, эукариотические системы имеют ряд отличий от прокариотических. Прежде всего, гибридные ГК, - 29 - содержащие и РО домен, редки у прокариот (5 из 30 ГК у E. coli), тогда как у эукариот все описанные ГК гибридные (с пока единственным исключением). Прокариотические РО являются, как правило,

транскрипционными факторами, тогда как только один из описанных пока эукариотических РО имеет ДНК-связывающий домен.

 

Хемотаксис у бактерий

Хемотаксис - способность бактерий двигаться по направлению к аттрактантам (зачастую питательным веществам) и от репеллентов (например,токсинов). В качестве аттрактантов выступают практически все сахара и аминокислоты, в качестве репеллентов - жирные кислоты, спирты и другие потенциально вредоносные вещества. Чувствительность бактерий впечатляет - они легко детектируют изменение концентрации на 0.1% при микромолярных концентрациях веществ, а диапазон детектируемых концентраций перекрывает пять порядков. Аттрактанты и репелленты детектируются за счет непосредственного взаимодействия со специфическими хеморецепторами, а не за счет каких-либо внутриклеточных эффектов детектируемого вещества. Мембранные рецепторы группируются в кластеры, как правило расположенные на полюсах клетки, однако это не может помочь бактерии уловить разницу концентраций между полюсами, поскольку она будет слишком маленькой из-за малого размера самой клетки. Вместо этого бактерии ориентируются в химических градиентах путем измерения временных изменений концентраций при движении. Обычно скорость движения эшерихии составляет 10-20 своих длин в секунду. Сравнивая текущую загруженность хеморецепторов специфическими лигандами с таковой несколько секунд назад, клетка фактически может "измерить" разницу концентраций определенного вещества на расстоянии, во много раз превышающем длину самой клетки. Такое измерение концентрации лиганда во времени возможно за счет адаптивного метилирования хеморецепторов, которое зависит от загруженности их лигандами. Задержка во времени между связыванием лиганда и метилированием рецептора представляет собой своеобразную молекулярную

"память", которая и позволяет измерять изменение концентраций лиганда. Если выбранное направление движения соответствует увеличению концентрации аттрактанта (снижению концентрации репеллента), время до следующего кувыркания увеличивается. К сожалению, из-за своего малого размера клетка постоянно сбивается с "верного" пути броуновским движением и поэтому просто не может продолжительно двигаться прямо. Такой механизм поэтому только в общем обеспечивает движение бактерии по градиенту концентрации в нужном направлении, но для бактерий является достаточно эффективным. Механизм, основанный на переключении направления вращения жгутиков, приводящий к прямолинейному движению, которое через варьирующие промежутки времени сменяется кувырканием

на месте, не является единственным. У Rhodobacter sphaeroides вращение единственного жгутика сменяется его полной остановкой, а у Rhizobium meliloti вращение жгутика никогда не прекращается – изменяется только его скорость. Но во всех этих случаях результат работы сенсорной системы хемотаксиса один и тот же – если бактерия движется в "нужном" направлении, продолжительность такого движения увеличивается.

Сенсорный механизм хемотаксиса более сложен, чем рассмотренные нами ранее. Это объясняется прежде всего двумя причинами. Во-первых, поскольку броуновское движение может очень быстро изменить ориентацию бактериальной клетки, клетки должны обрабатывать хемотаксические сигналы очень быстро, и, действительно, от стимула до переключения "моторов" у клетки проходит не более 0.2 секунды. Во-вторых, для правильного сравнения пространственных градиентов клеткам необходимо такое устройство сенсорного механизма, которое "гасило" бы сенсорную стимуляцию в статических условиях, т.е. в отсутствии градиента концентрации, как бы много какого-то аттрактанта или репеллента ни присутствовало бы в среде.

 

4. Устройство и принцип действия двигательного аппарата бактерий Движение бактерий рассмотрим на примере E. coli.Эта бактерия передвигается за счет вращения своих жгутиков, которые действуют как винты корабля.Каждая бактерия может иметь 6 или более "винтов", разбросанных по поверхности клетки случайным образом. Хотя каждый "винт" вращается независимо, но при вращении против часовой стрелки нити жгутиков сближаются за счет гидродинамических сил и образуют пучок, вращающийся в одну сторону позади клетки. Вращение против часовой стрелки приводит к более-менее прямолинейному поступательному движению бактерии, тогда как вращение по часовой стрелке заставляет бактерию кувыркаться на месте. В результате при последующем переключении направления вращения жгутика бактерия начнет двигаться в случайном направлении. В однородной среде бактерия кувыркается примерно раз в секунду.Нить жгутика является тонкой ровной трубкой, созданной из уложенных спирально молекул одного единственного белка – флагеллина. Длина жгутикового филамента варьирует и может достигать10 длин тела бактерии. Нить жгутика прикрепляется к базальному телу при помощи полого гибкого крюка. Крюк прикреплен к оси – полой прямой трубке, составляющей основу ротора жгутика. Ось окружена тремя кольцами – двойным MS кольцом, находящимся в цитоплазматической мембране ислегка выступающим из нее, P кольцом в слое пептидогликана и L кольцом в наружной мембране.Специфическая для компонентов жгутика система секреции III типа, располагающаяся в базальном теле, транспортирует через мембрану белки оси,крюка и нити в правильной последовательности и внужных количествах. Секретируемые компоненты поступают к месту сборки формирующегося жгутика через полость в его центре.Вращение жгутика обеспечивается молекулярным мотором, способным переключатьнаправление вращения.Источником энергии для работы мотора служит трансмембранный протонный градиент. Моторно-переключательный комплекс крепится на цитоплазматической стороне MS кольца и образуетколоколообразную структуру, известную как C-кольцо. Этот комплекс содержит три белка (FliG,FliM и FliN), участвующие в генерации вращательного монента и переключении направления вращения. Считается, что этот комплекс вращается вместе с MS кольцом, осью,крюком и нитью. Статор мотора сделан из двух белков, окружающих MS кольцо. Карбоксиконцевой домен одного из этих белков, MotB, закреплен в клеточной стенке, а четыре гидрофобных спирали MotA взаимодействуют с аминоконцевой мембранной α-спиралью, образуя проводящий протоны канал через цитоплазматическую мембрану.

 

55. Регуляция синтеза жгутикового аппарата

Более 40 генов, кодирующих белки,необходимые для биосинтеза жгутиков,организованы в несколько оперонов. Естественно,что экспрессия такого количества генов находится под строгим контролем. Контроль в данном случае организован иеархически. На вершине иерархии находится flhDC оперон, кодирующий два белка, из которых собирается гетеротетрамерный активации транскрипции генов второго "уровня". Многие глобальные регуляторы, такие, например, как БАК, DnaA, связанный с нуклеоидом белок H-NS,влияют на уровень экспрессии оперона flhDC и на образование жгутиков.Транскрипция генов первых двух уровней обеспечивается РНК-полимеразой с основным сигма-фактором (RpoD). Продуктами генов второго уровня являются белки,входящие в составбазального тела жгутика и крюка, а также регуляторные белки FlgM и FliA. FliA кодирует альтернативный сигма-фактор σ28 или σ F,необходимый для экспрессии генов третьего, и последнего уровня, а FlgM является анти-сигма фактором, ингибирующим активность FliA. Когда секреторный аппарат (базальное тело жгутика) и крюк собираются, FlgM экспортируется из клетки и освобождает FliA, который наконец может активировать поздние гены жгутика.

 

56. Белковый аппарат хемотаксиса. Рецепторы хемотаксиса.

Три класса белков участвуют в хемотаксисе: трансмембранные рецепторы, цитоплазматические сигнальные белки и ферменты адаптивного метилирования.
Рецепторы хемотаксиса. Многие бактерии детектируют хемотаксические стимулы при помощи рецепторов, известных как метилируемые белки хемотаксиса. Эти белки являются мембранными сенсорами, в принципе аналогичными по своей структуре EnvZ, с тем только отличием,что цитоплазматический сигнальный домен не является автокиназой. Функцию автокиназы выполняет другой белок - CheA, а сигнальные домены MCP(моноцитарный хемотаксический протеин) обеспечивают взаимодействие с CheA. Еще одно отличие от типичного сенсора - по обе стороны сигнального домена располагаются сайты метилирования, необходимые для адаптации рецепторов. MCP белки состоят из ок. 550 ак, и явл. димерами. Хорошо изучены 4 MCP из E. coli, реагирующие на серин (Tsr), аспартат и мальтозу (Tar),рибозу, глюкозу и галактозу (Trg) и дипептиды (Tap). У сальмонелл нет Tap, но есть сенсор цитрата Tcp. Серин, аспартат и цитрат связываются непосредственно с рецепторами, тогда как сахара и дипептиды сначала связываются с соответствующими периплазматическими белками, а уже эти комплексы взаимодействуют с рецепторами. Кроме того, MCP реагируют наизменения температуры и pH, а также являются рецепторами для различных репеллентов.
Классический рецептор состоит из

• аминоконцевой трансмембранной спирали,

• периплазматического собственно сенсорного домена, сложенного из четырех α−спиральных участков,

• второй трансмембранной спирали

• большого цитоплазматического сигнального

и адаптационного домена.

Цитоплазматические домены сенсоров содержат 4 или 5 остатков глутамата, доступных для метилирования.

 

57. Цитоплазматические сигнальные белки и регуляторный механизм хемотаксиса
Взаимодействие между рецепторами и переключателем жгутика осуществляется 4 белками:
♦ CheA – ГК(гистидиновая протеинкиназа)

♦ CheY – РО(регулятор ответа)

♦ CheW - "адаптор" между рецептором и CheA

♦ CheZ - белок, способствующий дефосфорилированию CheY~Ф
Пара белков CheA-CheY представляет собой двухкомпонентную регуляторную систему. CheY не является транскрипционным фактором и у него отсутствует ДНК- связывающий домен. ГК CheA функционирует в виде димера, с которым связываются два мономера CheW, и уже этот комплекс вступает в ассоциацию с димерным рецептором. В составе такого комплекса автокиназная активность резко возрастает, что усиливает перенос фосфата от CheА~Ф к CheY. CheY~Ф связывается с FliM моторно-переключательного комплекса базального тела, что приводит к вращению жгутика по часовой стрелке. CheZ предотвращает накопление CheY~Ф, стимулируя автофосфатазную активность CheY. При отсутствии аттрактанта концентрация CheY~Ф поддерживается на уровне, способствующем вращению жгутика преимущественно по часовой стрелке и отсутствию упорядоченного движения бактерии. Связывание аттрактанта с рецептором индуцирует конформационное изменение, которое передается через мембрану и подавляет автокиназную активность CheA. Концентрация CheY~Ф падает, и жгутики бактерии более продолжительное время вращаются против часовой стрелки. Поэтому клетки будут дольше двигаться прямолинейно, если они попадают в среду с более высокой концентрацией аттрактанта. Однако этот механизм не объясняет, как клетка может реагировать на постоянно возрастающую концентрацию аттрактанта.

 

 

58. Компоненты сигнальных путей (рецепторы, G-белки, адаптеры, эффекторы, вторичные мессенджеры).
Рецептор воспринимает экстраклеточный сигнал и запускает каскадный сигнальный механизм внутри клетки. Клетки обладают разными типами специализированных рецепторов, распознающих определенный вид сигнала.
G-белки — особые сигнальные молекулы, обладающие GTPазной активностью,были обнаружены и исследованы А.Гилманом и М. Родбеллом, которые получили за это открытие Нобелевскую премию по физиологии и медицине.G-белки делятся на две основных группы — гетеротримерные («большие») и «малые». Гетеротримерные G-белки — это белки с четвертичной структурой, состоящие из трёх субъединиц: альфа(α), бета (β) и гамма (γ). Малые G-белки — это белки из одной полипептидной цепи. Обе группы G-белков участвуют во внутриклеточной сигнализации.
Гетеротримерные G-белки. У всех гетеротримерных G-белков сходный механизм активации: они активируются при взаимодействии со специфическими рецепторами, сопряженными с G-белками, при этом обменивая ГДФ на ГТФ и распадаясь на α- и βγ-субъединицы.
Взаимодействие рецептора и лиганда приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адаптерами. Адаптер, связавшись с рецептором, вступает во взаимодействие с эффекторами.Адаптерные белки организуют белок-белковые взаимодействия через входящие в их состав SH2 и SH3 домены, передавая сигнал от рецепторов факторов роста к последующим эффекторам.
Эффектор формирует конечные сигналы управления и посылает их к объекту управления системы.
Вторичные мессенджеры — это низкомолекулярные органические соединения или ионы, способные обеспечивать дальнейшую передачу сигнала путем аллостерической регуляции. Активация последующих компонентов сигнальной цепи вторичными мессенджерами осуществляется при достижении ими определенной концентрации. На уровне эффекторов обеспечивается усиление сигнала, так как они синтезируют большое количество вторичных посредников, которые могут активировать множество последующих сигнальных посредников или конечных мишеней.

 

59. Киназы как компоненты сигнальных путей, типы протеинкиназ.
Сигнальные пути MAPK (митоген-активируемая протеинкиназа) — группа мультифункциональных внутриклеточных сигнальных путей, содержащих одну из митоген-активируемых протеинкиназ и контролирующих транскрипцию генов, метаболизм, пролиферацию и подвижность клеток и другие процессы. Сигнальные пути MAPK консервативны у эукариот и содержат характерный модуль, состоящий из трёх протеинкиназ. Эти пути активируются внеклеточными сигналами, такими как гормоны, факторы роста, хемокины и нейротрансмиттеры, которые распознаются соответствующими рецепторными тирозинкиназами или рецепторами, ассоциированными с G-белками. Рецепторы активируют ГТФазы семейств Ras и Rho. ГТФазы передают сигнал на модуль, состоящий из киназы киназы митоген-активируемой киназы, которая фосфорилирует и активирует киназу митоген-активируемой киназы, которая, в свою очередь, активирует митоген-активируемую киназу. MAPK фосфорилируют белки-мишени по остаткам серина и треонина и таким образом передают сигнал дальше. Кроме киназ, в состав сигнальных путей входят протеинфосфатазы и белки, которые обеспечивают сборку белковых комплексов.
Существует три типа протеинкиназ: Тирозинкиназы, серин/треонин протеинкиназы, которые обычно локализуются в цитоплазме, и протеинкиназы, которые могут фосфорилировать белки как по тирозину, так и по серину с треонином. Помимо рецепторных тирозин киназ существуют и тирозинкиназы, которые располагаются в цитоплазме клетки.
Тирозиновые протеинкиназы — ферменты, которые переносят фосфатную группу от АТФ наостаток аминокислоты тирозина в белке. Большинство тирозиновых киназ имеют сопряженные тирозинфосфатазы. Тирозиновые киназы классифицируют на две группы: цитоплазматические и трансмембранные (связанные с рецептором). Структура: АТФ-связывающий сайт, три АК-остатка,ассоциируемых со связыванием третьей фосфатной группы молекулы АТФ, связанной с энзимом, и возможный каталитический сайт, являющийся аминокислотой. Серин-треониновые протеинкиназы фосфоририруют гидроксильную группу в остатках серина или треонина. Активность этих протеинкиназ регулируется несколькими событиями (например, повреждениями ДНК), а также некоторыми химическими сигналами, в том числе, cAMP, cGMP, диацилглицеролом, Ca2+кальмодулином.

 

 

60. Способы передачи сигнала через клеточную мембрану
Важнейшим этапом, контролирующим функцию клеток, является момент превращения внеклеточных сигналов во внутриклеточные. Существует две группы механизмов, обеспечивающих трансмембранную передачу сигнала. Они различаются по способности связываться с рецепторами наружной мембраны клетки: ряд сигнальных молекул связывается с ними, другие – нет. Передача сигнала, не требующая наличия рецепторов на поверхности клетки. Относительно небольшое количество сигнальных молекул представлено веществами с низкой молекулярной массой или высокой степенью гидрофобности. В результате они достаточно легко преодолевают плазматическую мембрану за счет диффузии. Их классификация основана на особенностях взаимодействия с внутриклеточными компонентами. Выделяют две основные группы сигнальных молекул:

1. Сигнальные молекулы, взаимодействующие с внутриклеточными рецепторами. Наиболее известными представителями являются стероидные (кортизол, эстрадиол, тестостерон) и тиреоидные (тироксин) гормоны.

Пройдя через плазматическую мембрану, они связываются с белками, находящимися в цитозоле или ядре. Указанные рецепторные молекулы представляют собой генные регуляторные белки (gene regulatory proteins),изначально находящиеся в клетке в неактивном состоянии. Под действием гормонов они претерпевают большие конформационные изменения, что приводит к их связыванию с регуляторными участ-

ками цепочки ДНК. Как следствие, инициируется или прекращается транскрипция определенных генов. Характерными особенностями данной группы веществ являются: • большой латентный период действия: видимый эффект развивается спустя некоторое время (от 30 минут до нескольких часов), затрачиваемое на синтез новых белков; • продолжительное действие: развившийся эффект может сохраняться в течение нескольких часов (дней), даже после того, как концентрация действующего вещества во внеклеточной жидкости снижается до нуля.

2. Сигнальные молекулы, напрямую изменяющие ферментативную активность белка. Самым известным представителем является монооксид азота (NO), относящийся к группе газообразных медиаторов. За счет своих малых размеров NO быстро пересекает мембрану и, попадая в цитозоль, взаимодействует с гуанилатциклазой, катализирующей образование цГМФ, важнейшего внутриклеточного посредника. В отличие от гормонов, эффект развивается в течение нескольких секунд и сохраняется не столь продолжительное время. Передача сигнала, требующая наличия рецепторов на поверхности клетки. Большинство сигнальных молекул относится к гидрофильным высокомолекулярным веществам, неспособным пересекать цитоплазматическую мембрану ни путем диффузии, ни за счет каких-либо других систем транспорта. В этом случае рецепторы пронизывают мембрану,

что дает им возможность распознать сигнал на ее наружной поверхности со стороны внеклеточного пространства и обеспечить его передачу внутрь клетки. При этом сигнальная молекула не переносится через мембрану.