Контроль терминации транскрипции.

Регуляция терминации транскрипции. Существуют белковые факторы, одни из которых препятствуют, а другие способствуют терминации. В случае p-зависимой терминации регуляция синтеза белка возможна через воздействие на активность ρ-белка. Для прокариот известно два типа терминации транскрипции: ρ-зависимая и

ρ - независимая. Главным фактором терминации транскрипции у бактерий является белок ρ, или ρ-фактор, или Rho-фактор, состоящий из шести субъединиц.

До последнего времени считалось, что ρ-фактор, присоединившись к 5’- концу РНК, начинает двигаться по ней с той же скоростью, с какой РНК- полимераза движется по ДНК. В районе p-зависимого терминатора, отличающегося большим содержанием Г-Ц-пар азотистых оснований, РНК- полимераза притормаживает, так как ей трудно разрывать по три водородные связи в парах “гуанин - цитозин”. Поэтому р-белок, скорость которого осталась прежней, догоняет РНК-полимеразу и взаимодействует с ней, изменяя ее конформацию. В результате РНК-полимераза отделяется от ДНК. Согласно данной модели, ρ-фактор первоначально связан только со строящейся РНК, но не с РНК-полимеразой. Лишь позднее он взаимодействует с этим ферментом.

По современным представлениям, ρ-фактор сразу связывается с РНК- полимеразой на старте транскрипции, еще до возникновения какого-либо фрагмента РНК. Как только строящаяся РНК становится достаточно длинной, ρ-фактор “продевает” ее сквозь себя, при этом образуя из нее петлю, и начинает тормозить движение РНК-транскрипта с использованием энергии АТФ. Из-за образования петли нарастает пространственное напряжение, которое в районе ρ-зависимого терминатора приводит к изменению конформации ρ-фактора. Это, в свою очередь, изменяет конформацию РНК-полимеразы и инактивирует ее. В итоге элонгационный комплекс останавливается в зоне терминатора, а затем медленно распадается на составные элементы.

Антитерминация транскрипции - это подавление активности некоторых терминаторов. Например, у бактериофага X есть специальные белки-антитерминаторы N и Q. Белок N связывается с определенной структурой на строящейся мРНК и обеспечивает присоединение к ней четырех белков: S10, NusA, NusB, NusG. Образуется РНК-белковый комплекс, взаимодействующий с РНК-полимеразой и мешающей ей завершить трансляцию на ρ -зависимых и некоторых ρ -независимых терминаторах. Белок Q подавляет активность терминатора, связываясь не с РНК, а с ДНК.

Аттенюация - это регулируемая терминация, которая происходит лишь в том случае, если строящаяся мРНК приобретает определенную вторичную структуру. Смысл этого способа регуляции - остановить синтез ферментов А, В и С, закодированных в trp-опероне, если в клетке достаточно триптофана (на примере триптофанового оперона).

23. Антитерминация.

антитерминация -это подавление активности некоторых терминаторов. В случае антитерминации регуляторную функцию выполняет один белок, называемый антитерминатором. Этот белок предотвращает терминацию транскрипции и позволяет считываться генам, расположенным за терминатором, выполняя, таким образом, активаторную функцию. Антитерминаторы не взаимодействуют с кофакторами, а либо являются активными постоянно, либо их активность модулируется фосфорилированием. Классический пример антитерминации - регуляция жизненного цикла бактериофага λ. Геном фага лямбда имеет три группы генов: немедленно ранние (предранние), задержанно ранние и поздние. Названия групп отражают последовательность "включения", то есть активации транскрипции, этих генов. Оба этапа активации зависят от действия белков-антитерминаторов pN и pQ. Два предранних гена, N и cro транскрибируются "влево" и "вправо" от промоторов PL и PR. В самом начале литического цикла развития бактериофага транскрипция останавливается непосредственно после генов N и cro на ρ- зависимых терминаторах tL1 и tR1. Синтезирующийся в результате предранней транскрипции белок pN позволяет РНК-полимеразе преодолевать терминаторы tL1 и tR1 и считывать располагающиеся за ними ранние гены. Действие фактора ρ. Терминация транскрипции при участии этого белка происходит, когда Rho, связанный с вновь образованным транскриптом, взаимодействует с РНК-полимеразой, остановившейся в области ρ−зависимого терминатора. ДНК в области таких терминаторов не имеет особой структуры, богата основаниями C и бедна G, первичная последовательность различных терминаторов не имеет заметного сходства. Rho обладает РНК-зависимой АТФазной активностью и способствует отсоединению РНК-полимеразы через взаимодействие с белком NusG. Если в фаговой ДНК точно в том же месте заменить фаговый терминатор любым ρ-зависимым бактериальным терминатором, антитерминация по-прежнему будет происходить. Следовательно, белок pN не опознает не терминатор, а какой-то сайт, узнаваемый этим белком. Такие участки называются nutL и nutR для левого и правого терминатора соответственно. Когда pN узнает nut сайт, он должен подействовать на РНК-полимеразу таким образом, что она не сможет больше узнавать терминаторный сайт. Сравнение сайтов между собой показало, что они состоят из 17 н.п. палиндрома (может образовать небольшую шпильку). Мутации в этом сайте, называемом также boxB, лишают pN способности предотвращать терминацию. Непосредственно перед этим сайтом располагается октамерная последовательность, называемая boxA, также участвующая в антитерминации. Белок pN действует, скорее всего, опознавая шпилечную структуру, формируемую BoxB областью, непосредственно после ее синтеза РНК-полимеразой, одновременно контактируя с субъединицами полимеразы. После такого узнавания антитерминатор остается в комплексе с РНК- полимеразой, фактически становясь ее субъединицей и обеспечивая изменение ее специфичности по отношению к терминаторам.

24.. Посттранскрипционная регуляция
Регуляция экспрессии генов может происходить и после синтеза молекулы мРНК, в частности во время дозревания (процессинга) первичных мРНК. Основные способы такой регуляции – альтернативный сплайсинг, РНК-интерферренция и изменения стабильности РНК (изменения скорости деградации РНК).
Альтернативный сплайсинг – это вырезание экзонов и их объединение в разных комбинациях. Поэтому одна пре-РНК может давать несколько разных мРНК. Один ген может кодировать не один белок, а несколько. Например, во всех клетках есть ген кальцитонина, но в щитовидной железе он экспрессируется в виде гормона кальцитонина, в гипофизе - нейропептида CGRP. Альтернативный сплайсинг широко представлен в геноме человека, поэтому протеом человека содержит намного большее количество белков, чем протеомы других организмов.
РНК-интерференция – это торможение экспрессии гена на стадии трансляции или транскрипции действием малых РНК. Они выключают роботу тех генов, последовательности которых отвечают цепи молекулы малой РНК.
Деградация мРНК. Время жизни эукариотических мРНК составляет от нескольких часов до нескольких дней, а прокариотических – несколько минут. Продолжительность жизни мРНК является важным механизмом регуляции синтеза белков. Разрушение мРНК у эукариот осуществляется 3’-РНК-азами (у прокариот 5’-РНК-азами). мРНК эукариот начинает разрушаться с некодирующего полиаденилатного фрагмента. Этот фрагмент подобно теломерным последовательностям ДНК служит буферной зоной, которая защищает кодирующую часть мРНК от разрушения. В промежутке между завершением трансляции мРНК одной рибосомой и началом трансляции следующей 3’-РНК-аза успевает отщепить от ее поли(А) фрагмент 10-15 нуклеотидов. Когда в этом фрагменте остается около 50 нуклеотидов (критическая длина), быстро наступает полный гидролиз мРНК. Кратность трансляции мРНК обычно не превышает 10-15 раз. Разница в продолжительности жизни различных мРНК объясняется как разной длиной поли-(А) -фрагмента, так и тем, что в короткоживущих мРНК между кодирующей частью и полиаденилатным фрагментом находятся АУ-багатые элементы. Наличие последовательностей обогащенных аденином и урацилом резко усиливает деградацию поли(А) -фрагмента.

 

25. Контроль процессинга пре-мРНК (транс-сплайсинг, альтернативный сплайсинг, альтернативное полиаденилирование).
Эукариоты широко используют возможность регулировать синтез белка на посттранскрипционном уровне. Возникшая при транскрипции пре-мРНК у эукариот претерпевает процессинг. Регулировать образование зрелых мРНК можно через изменение активности ферментов и вспомогательных белков, нужных для кэпирования, образования полиА-хвоста, обычного и альтернативного сплайсинга.

Альтернативный сплайсинг позволяет получить различные белковые продукты с одного гена благодаря “сшиванию” разных наборов экзонов и интронов при построении разных мРНК. Большое значение имеют присущие эукариотическим клеткам механизмы управления альтернативным сплайсингом. Характер сплайсинга регулируется белками, способными связываться с пре-мРНК в районе интронов или на границе “экзон-интрон”. Присоединение таких регуляторных белков может блокировать удаление одних интронов, одновременно активируя вырезание других.

На конечный результат - синтез белка - влияет также скорость транспорта РНК из ядра в цитоплазму, время “полужизни” мРНК, степень ее стабильности в цитоплазме, скорость поступления на рибосомы и эффективность связывания с ними.

’’Временем полужизни” называют время, в течение которого популяция молекул данного типа мРНК уменьшается наполовину. Известно, что время существования мРНК увеличивается с удлинением ее полиА-хвоста. Время полужизни большинства мРНК дрожжей составляет 10-20 мин, хотя для некоторых оно уменьшается до 1 мин, а для других возрастает до 35 мин. У млекопитающих время полужизни мРНК обычно составляет несколько часов.

Клетка имеет возможность резко снизить время полужизни нежелательных мРНК (например, вирусных): с помощью особых малых РНК и специальных белковых комплексов такие мРНК обнаруживаются и расщепляются. Этот механизм носит название РНК-интерференции, или посттранскрипционного генного сайленсинга.

Скорость освобождения РНК от сопровождающих белков и поступления на рибосомы регулируется белками, окружающими ее в информосомах (РНП- комплексах). В цитоплазме мРНК могут определенное время храниться в виде нетранслируемых мРНП-комплексов.

Некоторые из белков этих комплексов участвуют в регуляции матричной активности мРНК. Например, если в РНП-комплексе на одну молекулу мРНК приходится 5 - 10 молекул белка p50, трансляция этой РНК ингибируется, если 1-4 молекулы - активируется. Предполагают, что при более высоком содержании белка его С-концевые части освобождаются от контактов с РНК и начинают взаимодействовать между собой. Это приводит к мультимеризации белка и переходу мРНП в конденсированное (нетранслируемое) состояние.

В процессе транс-сплайсинга сплайсома выбирает для объединения 5'-сайт и 3'- сайт сплайсинга, которые располагаются на разных молекулах РНК. Транс-сплайсинг обнаружен у простейших (трипаносом), евглен, нематод и плоских червей, а также в митохондриях, хлоропластах и безрибосомных пластидах высших растений. Наиболее хорошо изучен механизм транс-сплайсинга у нематоды.

Полиаденилирование - присоединение аденина к 3'-концу мРНК- это один из вариантов посттранскрипционного процессинга (модификации) мРНК, играющий значение, в том числе и в регуляции экспрессии генов. Процессинг 3'-конца является важным этапом в созревании мРНК у всех эукариот. Полиаденилирование необходимо для терминации транскрипции, для транспорта мРНК из ядра, стабильности (защищает мРНК от деградации нуклеазами) и инициации трансляции.
Полиаденилирование- двухэтапная реакция:
1)сайт-специфичное разрезание пре-мРНК
2)синтез поли-А хвоста определенной длины на 3'-конце порезанного продукта.