Рабочий цикл шаперонных комплексов GroELS и DnaKJ-GrpE.

Молекулярные шапероны – группа вспомогательных специализированных белков, предохраняющих растущую цепь от

ошибочных внутренних и внешних контактов. Биологические функции молекулярных шаперонов - коррекция структуры и конформации других белков клетке, предотвращение агрегации неправильно свернутых или частично развернутых белков, разрушение и солюбилизация стабильных

белковых агрегатов, разворачивание нативных белковых субстратов для транслокации их через мембраны, разборке активных олигомерных структур и поддерживании их в состоянии неактивных мономеров, разворачивании активных мономеров для их последующей деградации. Шапероны контролируют процессы ремоделирования нативного состояния регуляторных и сигнальных белков в клетке. Молекулярные шапероны являются основными компонентами системы контроля качества клеточного

протеома.

Hsp70-система Escherichia coli, состоит из шаперона DnaK, кошаперона DnaJ и NEF-белка GrpE, причем, белки DnaJ и GrpE функционируют в системе в форме димеров. Гомологом Hsp60 у E. coli является GroEL, формирующий гигантский комплекс с GroES. Комплекс GroEL- GroES имеет сходство с эукариотической протеосомой 26S, ответственной за деградацию меченных убихитином белков.

При фолдинге белки проходят через ряд промежуточных конформаций, имеющих более высокую энергию, чем конечная конформация. Поэтому для многих белков существуют локальные энергетические минимумы, в которых частично свернутый белок может задержаться надолго. Белки, требующие помощи в фолдинге, опознаются аппаратом DnaK-DnaJ-GrpE, через гидрофобные участки. Молекулярный шаперон, гидролизуя АТФ, "перетасовывает" конформацию многих оснований, разворачивая белок и позволяя ему свернуться заново. Если нативная конформация не достигается таким путем, белок переходит в ведение шаперонина GroES-GroEL. Полость шаперонина защищает белок от контакта с раствором и другими субъединицами, предотвращая агрегацию и позволяя белку спокойно свернуться.

39. Деградация белков: АТФ-зависимые протеазы прокариот и 26S-протеасома эукариот. АТФ-зависимые протеазы прокариот и 26S-протеасома эукариот

 

АТФ-зависимые протеазы. За распознавание субстрата у прокариот отвечают протеазы, поэтому их в клетке несколько. АТФзависимые протеазы-крупные олигомерные комплексы. Протеазные сайты располагаются во внутренней камере олигомера. Поступление субстрата в такую полость обеспечивается АТФазными доменами (субъединицами). Поскольку распознавание субстратов осуществляется регуляторными АТФазами, свойства субстратов, приводящие к их деградации, не зависят от свойств, необходимых для разрезания пептидных связей. Как только белок распознается и связывается регуляторным АТФазным доменом, начинается последовательная деградация полипептидной цепи с разрезами через каждые 5-10 аминокислот. У E.coli 4 АТФ-зависимые протеазы. ClpAP ClpXP. У этих протеаз АТФазная и протеазная активность принадлежат разным субъединицам, эти субъединицы способны действовать самостоятельно. ClpA и ClpX могут действовать как шапероны. Гены clpX и clpP составляют оперон, clpA расположен отдельно в моноцистронном опероне. Оба оперона имеют типичные промоторы теплового шока. ClpYQ/HslUV. HflB(FtsH). Zn и АТФ-зависимая протеаза, участвующая в деградации цитоплазматических и мембранных белков, включая RpoH, SecY (часть аппарата секреции). Единственная АТФ-зависимая протеаза, существенная для жизни E. coli. В опероне с RpoH-зависимым промотором. Lon. Деградирует белок N фага λ, ингибитор клеточного деления SulA, позитивный регулятор биосинтеза капсулы RcsA и др. Кроме специфических мишеней, Lon деградирует большинство аномальных белков E. coli. Белок – гомотетрамер, имеет сайты связывания с АТФ и ДНК, причем связывание с ДНК стимулирует протеазную активность. Транскрибируется с промотора теплового шока. В белке можно выделить два домена – собственно протеазный с карбоксильного конца с сериновым остатком в активном сайте

и следующий за ним АТФазный. Эти два домена могут быть экспрессированы как отдельные полипептиды, смесь которых функционально соответствует интактной протеазе Lon. 26S ПРОТЕАСОМА. Протеасома, осуществляющая убиктивин-зависимую деградацию белков, состоит из двух основных субкомплексов: коровой 20S протеасомы и активатора РА700 или 19S регуляторной частицы. 20S протеасома содержит протеазные субъединицы, а 19S протеасома включает субъединицы, способные связывать полиубиктиновые цепи и субстрат, а также изопептидазы, отщепляющие убиктивин, и АТФазы, которые обеспечивают разворачивание субстрата и транслокацию его в канал коровой протеасомы. 19S протеасомы могут присоединяться к 20S протеасоме с одного или обоих концов, в результате образуются 26S и 30S протеасомы соответственно. Помимо 19S RP, в состав 26S протеасомы могут входить альтернативные регуляторные частицы: PA28α/β (или 11S REG), PA28γ (или REGγ), PA200, PI31. Встречаются асимметричные изоформы 26S протеасомы, содержащие разные регуляторные частицы на концах 20S протеасомы. Кроме того, обнаружены изоформы протеасомы, в которых регуляторные частицы замещены мультисубъединичным белковым комплексом PC530 или COP9 сигналосомой.

40.Механизм распознавания аномальных белков.
Аномальные белки возникают в результате ошибок при синтезе, когда в цепь встраивается неправильная аминокислота, или в результате химических повреждений, таких, как окисление боковых цепей аминокислот. Разнообразные мутантные формы обычных белков также распознаются в качестве аномальных. Механизм «узнавания» аномальных или нефункциональных белков неизвестен, скорее всего, важную роль в нем играют особенности третичной структуры белков, и замена даже одной аминокислоты сильно снижает устойчивость белка к внутриклеточному протеолизу. Последнее обстоятельство может существенно мешать получению микроорганизмов-сверхпродуцентов, у которых повышенное образование целевого продукта обусловлено мутациями по соответствующим ферментам. Такие ферменты будут восприниматься системой узнавания как аномальные и подвергаться протеолизу, что тормозит биосинтетические процессы, а иногда и рост микроорганизма. Специфический протеолиз может дополнять регуляцию по механизму катаболитной репрессии. Решающую роль играет протеолиз в так называемой SOS-регуляции, т.е. активации SOS-регулона, включающего около 20 генов, которые индуцируются в ответ на некоторые повреждения ДНК и образуют продукты, участвующие в ее репарации. Среди этих продуктов присутствует белок RecA, участвующий в ряде клеточных процессов является более «быстродействующим» механизмом

и раньше откликается на изменение внешних условий, чем регуляция

биосинтеза этих посредников. Оба уровня регуляции необходимы для координированного управления биохимическими процессами в клетке. В свою очередь, процессы регуляции активности белковых посредников можно разделить на две большие группы: регуляция активности путем обратимой ковалентной модификации посредника и регуляция активности без ковалентной модификации посредника.

 

41. Система убиквитинирования белков

Убиквитинлигаза (англ. E3 ubiquitin ligase) — фермент-лигаза, ковалентно присоединяющий убиквитин к белку-мишени изопептидной связью. Убиквитинлигазы являются частью системы убиквитинопосредованного распада белка в протеасомах. Известно, что протеасома расщепляет не любые белки, а только те, которые были «помечены» убиквитином. Убиквитинлигазы специфично узнают белки-субстраты и участвуют в их полиубиквитинировании (присоединении цепочек из молекул убиквитина), которое, в конечном счёте, приводит к деградации последних в протеасомах. Кроме этого, убиквитинлигазы осуществляют и другие модификации белков убиквитином, такие как моноубиквитинирование и мультиубиквитинирование, которые имеют регуляторное значение.

Механизм убиквитинирования белков. Процесс убиквитинирования белков происходит в несколько стадий, ферменты, катализирующие отдельные его этапы, получили условные названия Е1 (убиквитинактивирующий фермент), Е2 (убиквитинконъюгирующий фермент) и Е3 (убиквитинлигаза). Фермент Е1 АТФ-зависимо активирует убиквитин с формированием высокоэнергетической тиоэфирной связи между карбоксильной группой С-концевого остатка глицина убиквитина и остатком цистеина в молекуле Е1. Затем активированный убиквитин переносится на молекулу Е2 с формированием сходной тиоэфирной связи. Убиквитинлигазы взаимодействуют одновременно с Е2 благодаря Е2-связывающему домену и с белком-субстратом благодаря субстратсвязывающему домену. Они осуществляют перенос активированного убиквитина с Е2 на субстрат либо напрямую, либо через образование промежуточного тиоэфирного соединения.Чаще всего убиквитин-лигазы катализируют образование изопептидной связи между карбоксильной группой С-концевого остатка глицина убиквитина и ε-аминогруппой одного из остатков лизина в белке-мишени, реже связь образуется между убиквитином и N-концевой аминогруппой или боковой цепью цистеина белка. После присоединения первой молекулы убиквитина к субстрату Е3-ферменты последовательно добавляют ещё несколько молекул, так же соединяя их изопептидной связью. Эта модификация называется полиубиквитинированием. В молекуле убиквитина присутствуют 7 остатков лизина, каждый из которых, как считают, может участвовать в образовании изопептидной связи. Последствия полиубиквитинирования зависят от того, какой из этих остатков был задействован в формировании цепочки. Так, полиубиквитиновые цепи, соединённые при участии Lys-48, чаще всего являются сигналом к протеасомальной деградации (минимальная длина цепочки — 4 молекулы убиквитина), а образованные через Lys-63 играют регуляторную роль в эндоцитозе белков(процесс транспорта макромолекул внутрь клетки (белков, полисахаридов, полинуклеотидов и т. д.) и репарации ДНК. Также выделяют и другие типы модификаций, катализируемых Е3-ферментами: моноубиквитинирование (присоединение единственного остатка убиквитина) и мультиубиквитинирование, или множественное моноубиквитинирование. Моноубиквитинирование — довольно распространённая регуляторная посттрансляционная модификация, которая может влиять на способность белка взаимодействовать с другими молекулами, на его внутриклеточную локализацию, а также может служить сигналом к его деградации в лизосомах. Мультиубиквитинирование мембранных белков приводит к их эндоцитозу и расщеплению в лизосомах. Убиквитинлигазы разделяют на три семейства в зависимости от структуры домена, связывающего убиквитинконъюгирующий фермент (E2): убиквитинлигазы, содержащие HECT-домен(homologous to E6-AP carboxyl terminus), RING-домен (англ. really interesting new gene) или U-бокс.