Механизмы окислительных повреждений клетки, защита от окисл. стресса.

Механизмы окислительных повреждений клетки. (H2O2 – перекись/пероксид водорода)

Наиболее чувствительными к окислительным повреждениям являются различные дегидратазы, использующие железо-серные кластеры [4Fe-4S] для связывания и дегидрирования субстратов. Окисление таких дегидратаз супероксид-ионом вызывает разрушение Fe-S кластеров и потерю активности. Кроме того, побочным продуктом такого окисления являются многочисленные ионы железа, высвобождаемые в цитоплазму, где они совместно с H2O2 катализируют окисление ДНК. H2O2 эффективно окисляет тиолы, поэтому повреждает множество дегидрогеназ, использующих остатки цистеина в каталитическом центре. Кроме того, взаимодействие H2O2 с ионами Fe2+ дает сильнейший окислитель HO• (гидроксил), способный взаимодействовать практически со всеми биомолекулами, в первую очередь с ДНК, с чем и связана в первую очередь летальность действия H2O2.

Защита от окислительного стресса.

Для защиты от окислительного стресса клетка использует целый ряд антиоксидантных ферментов и систем репарации, большинство которые экспрессируется на низком базальном уровне в нормальных условиях. При воздействии супероксида и перекиси водорода экспрессия многих антиоксидантных белков индуцируется, что зависит в основном от действия двух регуляторов – SoxRS и OxyR.

SoxRS регулон

SoxRS в ответ на супероксид регулирует экспрессию не менее 10 белков, включая

супероксиддисмутазу (SodA), участвующую в репарации ДНК эндонуклеазу IV (Nfo) и резистентные к супероксиду изоформы фумаразы (FumC) и аконитазы (AcnA).

SoxRS обеспечивает увеличение концентрации глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Zwf), что усиливает восстановительную силу клетки, и увеличение количества репрессора метаболизма железа Fur, что снижает поглощение железа и, следовательно, снижает выработку гидроксила.

Индукция регулона происходит в два этапа. Сначала редокс-сенсорный белок SoxR под влиянием супероксид-иона индуцирует транскрипцию soxS, а затем уже SoxS непосредственно активирует гены- мишени, связываясь с их промоторными областями.

OxyR регулон

Другой транскрипционный фактор, OxyR, в ответ на H2O2 активирует синтез примерно 30 белков (четко показан контроль через OxyR только для 9 из них), в том числе каталазы (гидропероксидазы I, KatG), двух субъединиц алкилгидропероксид редуктазы (AhpCF), глутаредоксина (GrxA), глутатион редуктазы (GorA), Mn-супероксиддисмутазы и Fur-репрессора. Регулируемые OxyR неспецифический ДНК-связывающий белок Dps (DNA-binding protein from starved cells) и регуляторная РНК OxyS защищают от мутагенеза. Активируется также синтез ряда генов теплового шока и регулятора синтеза капсульных полисахаридов.

Адаптация к анаэробиозу.

Основные регуляторы - FNR (fumarate and nitrate reduction) и ArcA (aerobic respiratory control) Оба белка являются транскрипционными факторами, активирующимися в анаэробных условиях и инактивирующихся при взаимодействии с кислородом. FNR детектирует кислород непосредственно через редокс-чувствительный Fe-S кластер, входящий в его структуру, тогда как активность ArcA зависит от его фосфорилирования, контролируемого мембранной гистидинкиназой ArcB. В отличие от FNR ArcB не детектирует содержание кислорода непосредственно, а реагирует на общее состояние клетки. В связи с этим два регулятора реагируют на различные концентрации кислорода и контролируют разные, но частично перекрывающиеся наборы генов. Это позволяет бактерии быстро и эффективно приспосабливаться к широкому диапазону концентраций кислорода.

FNR как сенсор кислорода

FNR – глобальный регулятор, контролирующий экспрессию более 120 генов у E. coli. Белок был идентифицирован путем изоляции мутантов, неспособных восстанавливать нитрат и фумарат. Позже было показано, что белок отвечает за индукцию в анаэробных условиях таких ферментов цикла Кребса как сукцинат дегидрогеназа, фумараза, изоцитрат дегидрогеназа, участвующих в производстве энергии. Активация транскрипции белком OxyR путем окислительного фосфорилирования. FNR также активирует экспрессию ферментов анаэробного дыхания, которые используют альтернативные конечные акцепторы электронов, такие как DMSO, фумарат или нитрат. Помимо активации экспрессии необходимых в анаэробных условях белков FNR также репрессирует такие аэробные респираторные ферменты как цитохромоксидаза и NADH дегидрогеназа.

Интересно то, что по аминокислотной последовательности FNR похож на БАК (белковый активатор катаболизма). Mеханизм активации транскрипции обеими белками тоже одинаков - оба активируют транскрипцию, контактируя с α-субъединицей РНК-полимеразы. Единственным существенным отличием FNR является дополнительный участок на амино-конце этого белка, несущий ферредоксинообразный кластер из четырех цистеиновых остатков (Cys-X3-Cys-X2-Cys-X5-Cys), что привело к предположению о детекции кислорода при помощи железо-серных кластеров.

При взаимодействии с кислородом два [4Fe-4S]2+ кластера димера FNR быстро (за пару минут) превращаются в два [2Fe-2S]2+ кластера, причем железо остается связанным с окисленным FNR, скорее всего в виде сульфида (Рис. 9.4). Если клетку быстро вернуть в анаэробные условия, [2Fe-2S]2+ центры быстро возвращаются в исходное [4Fe-4S]2+ состояние.

Широкий диапазон концентраций кислорода детектируется клетками E. coli.

Анаэробное дыхание у этой бактерии происходит в диапазоне концентраций кислорода 1-5 µМ (при наличии соответствующих акцепторов электронов), при более низкой концентрации бактерия переключается на брожение. Именно в этом диапазоне концентраций и происходит переход FNR из неактивной в активную форму.

ArcB реагирует на изменения концентрации кислорода на границе микроанаэробной и анаэробной зоны. Этот белок скорее всего реагирует на изменения электронтранспортной цепи (трансмембранного протонного потенциала или же степени окисления какого-то переносчика электронов). Вторым сигналом, на который может реагировать ArcB, является концентрация анаэробных метаболитов.

ArcB работает в паре с РО ArcA. На сегодняшний день регулон ArcA насчитывает более 30 генов, кодирующих ферменты цикла Кребса (флавопротеиновые дегидрогеназы, цитохромоксидазы и т.д.), глиоксилатного шунта и деградации жирных кислот. Регуляция в основном заключается в репрессии при анаэробиозе синтеза ферментов аэробного дыхания, хотя ArcA также активирует несколько генов в микроанаэробных условиях.

 

75. Утилизация азота. & 76. Детекция внутриклеточной концентрации азота, компоненты регуляторной системы.

Бактерии могут использовать множество азотсодержащих соединений в качестве источника клеточного азота - от простейших неорганических (азот, нитрат) до сложных соединений включая аминокислоты и нуклеозиды.

Аммиак является наиболее предпочтительным источником азота практически для всех бактерий. Однако бактериям чаще приходится утилизировать альтернативные источники азота, для чего они синтезируют множество белков, необходимых для транспорта внутрь клетки и последующего метаболизма азотсодержащих соединений.

Практически у всех бактерий глутамат и глутамин служат как основные доноры азота в биосинтетических реакциях. За образование этих аминокислот практически у всех бактерий отвечают два фермента. Первый, глутамин синтетаза, продуцирует глутамин из глутамата и аммиака, тогда как второй, глутамат синтетаза, переносит аминогруппу с глутамина на 2-кетоглутарат с образованием двух молекул глутамата.

Суммарным результатом этих двух реакций является продукция глутамата из аммиака и 2-кетоглутарата. Эти реакции катализируются двумя ферментами: Глутаминсинтетаза (GlnA) и Глутаматсинтетаза.

Глутаминсинтетаза (GlnA). Додекамерный фермент, состоящий из 12 идентичных субъединиц.. Субъединицы организованы в два шестичленных кольца, лежащих друг на друге и сдерживаемых гидрофобными взаимодействиями и водородными связями. Активность фермента регулируется путем аденилирования. Аденилирование происходит в ответ на увеличение внутриклеточной концентрации аммония - чем выше его концентрация, тем больше субъединиц GlnA инактивировано. Этот процесс катализируется аденилилтрансферазой (GlnE), основной функцией которой является преодоление последствий "аммонийного шока", происходящего при попадании бактерий из бедной азотом среды в богатую.

Глутаматсинтетаза - гетеродимер, субъединицы которого кодируются генами gltBD. Синтез глутаматсинтетазы находится под контролем Lrp (leucine-responsive regulatory protein), что приводит к репрессии синтеза фермента в богатой среде.

У бактерий семейства Enterobacteriaceae система регуляции метаболизма азота кодируется четырьмя генами:

1.glnD, кодирующим уридилтрансферазу/деуридилазу (UTase/UR).

2.glnB, кодирующим малый регуляторный белок P_II.

3.ntrB, кодирующим гистидинкиназу.

4.ntrC, кодирующим регулятор ответа - транскрипционный энхансер.

Белок NtrB (продукт гена glnL) является типичной сенсор-киназой. Цитоплазматическим сигналом, детектируемым NtrB, является белок P_II, который в уридилированной форме сигнализирует о недостатке, а в немодифицированной форме - об избытке азота. При нехватке азота NtrB катализирует фосфорилирование и, следственно, активацию регулятора ответа NtrC.

У кишечных бактерий подвержены регуляции через NtrC многие гены - glnA ntrBC; гены, кодирующие транспорт глутамина (glnHPQ), аргинина (argT) и гистидина (hisJQMP); гены, необходимые для ассимиляции нитрита и нитрата (nasFEDCBA); регуляторные гены фиксации азота nifLA у K. pneumoniae и nac у K. aerogenes.

Уридилтрансфераза (GlnD). Этот белок отвечает как за присоединение уридинмонофосфата к P_II (GlnB), так и за его отсоединение. Количество внутриклеточного азота отражается на соотношении концентраций глутамина и 2-кетоглутарата (высокое при избытке и низкое при недостатке азота), что влияет на активность уридилтрансферазы. Активность этого фермента стимулируется 2-кетоглутаратом и АТФ и ингибируется глутамином. Следовательно, степень уридилирования P_II (GlnB) зависит от соотношения концентраций глутамина и 2-кетоглутарата. P_II (GlnB).

 

Контроль клеточного цикла.

Клеточный цикл: события в клетке от деления до деления

Большинство бактерий размножаются путем деления клетки на 2 части. Деление грамположительной бактериальной клетки осуществляется после репликации ДНК. Мезосомы формируют поперечную перегородку в клетке бактерии от периферии к центру. Особенность бесполого способа размножения грамотрицательных бактерий состоит в том, что деление происходит путем формирования перетяжки (септального кольца) при втягивании мембраны и клеточной стенки внутрь клетки.

Некоторые размножаются почкованием. Почкование представляет собой процесс образования и роста почки на одном из полюсов материнской клетки, которая проявляет признаки старения и не дает более четырех дочерних клеток.

Половой процесс отмечен лишь в немногих случаях (у кишечной палочки). Половое размножение у бактерий осуществляется в примитивной форме. У бактерий не образуются гаметы, и нет слияния клеток. Однако самое важное событие полового процесса происходит – это обмен генетическим материалом, что именуется генетической рекомбинацией. Одна клетка в этом случае служит донором («мужская» клетка), другая — реципиентом («женская» клетка). Способность клетки служить донором определяется генами, содержащимися в особой плазмиде, называемой половым фактором или F-фактором (F от англ. fertility — плодовитость). В этих генах закодирован белок специфических пловых пилей. Пили — структуры полые и предполагается, что именно по этим пилям осуществляется перенос ДНК от донора (F+) к реципиенту (F-). Новообразованная рекомбинантная ДНК бактерии содержит гены обеих родительских клеток.

Для бактерий характерен высокий темп размножения: деление происходит быстро (через 20-30 минут). При такой интенсивности потомство одной бактерии за 5 суток заполнило бы бассейны всех морей и океанов.

Однако размножение их ограничено климатическими условиями, действием солнечного света, борьбой между видами, накопления продуктов обмена веществ и т. д. При неблагоприятных условиях палочковидные бактерии способны образовывать споры. Спорообразование не является размножением, т.к. из каждой клетки формируется одна спора и число особей при этом не возрастает. Спора развивается внутри клетки бактерии: до 60% воды переходит в связанное состояние, протопласт сжимается и покрывается очень плотной оболочкой. Оболочка бывшей клетки разрушается и спора освобождается. Она способна сохранять жизнеспособность в течении многих лет (устойчива против высушивания, высоких и низких температур, ядовитых веществ). При наступлении благоприятных условий споры набухают, оболочки разрываются и молодые сформировавшиеся клетки выходят наружу. Таким образом, спора (у бактерий) - стадия переживания неблагоприятных условий.