Контроль стрессовых регулонов бактерий

Наиболее изуч-ми с-ми стрессовых ответов бактерий явл-ся: теплового и холодового шока, стресса клет. стенки, направл-ми на адаптацию к темп-му стрессу, с-ми общего и жесткого ответа, направл-ми на адаптацию к пищевому стрессу, и SOS-ответа, защищающего клетки от мутагенного влияния повреждающих ДНК в-в. Р-ция теплового шока явл-ся ответом клетки не только на повышенную темп-ру окр. среды, но и на возд-ие ряда хим. в-в, т. е. на те факторы, кот-ые м/т приводить к образ-ию некорректно собранных / поврежденных Б в кл., имеющих тенденцию к образованию белковых агрегатов, угрожающих функц-ию всех клет-ых компартментов. Во избежание этой угрозы при р-ии теплового шока происходит усиленная экспрессия белковых шаперонов и АТФ-зависимых протеаз, т. е. Б, уч-щих в орг-ии третичной стр-ры и в деградации некорректно собранных клеточных Б. Весь регулон (с-ма генов, разбросанных по всему геному, но подчиняющихся общему регуляторному Б.) теплового шока (более 30 белков) нах-ся под контролем альтернативного сигма-фактора транскрипции σ32. Релаксация ДНК (проц. превращения суперскрученных мол-л ДНК в мол-лы, не сод-ие супервитков,) под действием ингибиторов гиразы / темп-ры ведет к активации транскрипции регулона теплового шока.

Условия окр. среды, нарушающие пространство грамотриц. бактерий, состоящее из внутр. мембраны, периплазма и внеш. мембраны, вызывают р-ию стресса клет. стенки: одно из таких усл. – темп-ра, еще более высокая, чем та, которая индуцирует регулон теплового шока (45–50 °С). У E. coli сущ-ют, как мин-м, 2 с-мы стресса клет. стенки, одна зависит от альтернативного сигма-фактора транскрипции σE, др. контрол-ся мембранной сигнальной гистидинкиназой CpxA. σE-ответ запускается в первую очередь неправильно свернутыми Б внеш. мембраны, а CpxA-ответ – Б периплазмы и внутр.й мембраны. Оба регулона увел-ют с-з экстрацитоплазматических протеаз, фолдаз и шаперонов для восста-ия целостности клет. стенки.

ХШ. вызывает несколько проблем на клет. ур.: при снижении темп-ры ниже 20 °С ингибируется трансляция на рибосомах, РНК и ДНК образуют стабильные втор. Стр-ры, кроме того, снижается текучесть мембраны. Этим негативным для кл. эффектам противодействует ответ холодового шока, в ходе которого индуцируется синтез белков CspA, CspB, CspG и CspI – ДНК- и РНК-связывающих Б, действ-их как активаторы транскрипции / РНК-шапероны, препят-ие стабилизации вторич. стр-р РНК. С-з др. Б холодового шока обесп-ет акт-ть рибосом даже при низких темп-ах, а сохр-ние оптим-ой текучести мембраны достигается за счет увел-ия сод-ия в ней ненасыщенных жирных к-т. Когда кл. E. coli входят в стационарную фазу / испытывают ограничение в пит-ных в-вах, у них индуцируется р-ия общего стрессового ответа, главным регулятором которой явл-ся сигма-фактор σS, кодируемая геном rpoS, под контролем которого находится около 200 генов. Кроме ограничений в пит-ых в-вах и голодания, общий стрессовый ответ индуц-ся замедлением скорости роста, высоким осмот-им давлением, низким pH, резкими скачками температуры и окислительным стрессом. Регулон общего стрессового ответа во многом перекрывается с др. стрессовыми регулонами, что делает кл. готовыми к одновременному возд-ию многих стрессовых факторов. Клетки E. сoli, испытывающие дефицит АК / пониж-ый ур.ь пит-ых в-в, м/т отвечать на этот стресс посредством р-ии строгого ответа, кот-рая запускается нетипичными гуанозин-полифосфатными нуклеотидами и выр-ся в быстром прекращении с-за транспортных и рибосомных РНК, снижении ур. с-за Б и активации биосинтеза АК.

64. Физиологические функции, находящиеся под контролем альтернативных сигма-факторов.
Альтернативный σ-фактор контрол-ет бол-во генов азотного мет-ма. Альтернативные σ-факторы σ70 этого семейства, в свою очередь, могут быть сгруппированы в три подсемейства, контролирующих споруляцию, подвижность и разнообразные внецитоплазматические ф-ии (с-з секретируемых Б, тр-т железа, р-ия на различные стрессовые возд-ия).Представители сем-ва σ54 также присутствуют у многих бактерий и контролируют азотный метаболизм, синтез ряда гидролаз и жгутиковых белков.

Альтернативный сигма фактор 54 уч-ет в транскрипции генов с различными физиол-ми ф-ми: гены ассимиляции азота Е. coli и S. typhimurium, гены с-мы жгутиков P. aeruginosa, V. cholerae и Caulobacter crescentus, и гены пилинов, необх-ые для вирулентности Р. aeruginosa и Neisseria gonorrhea.

 

 

65. Промоторы и регуляторные белки, участвующие во взаимодействии с альтернативными сигма-факторами
Узнавание промотора у бактерий требует ассоциации кор-фермента РНК-полимеразы с сигма (σ) субъед-ей, что дает активный холофермент. Все свободноживущие бактерии сод-ат множественные сигма-факторы (у некот. описано до 10-20). К числу таковых относятся основной сигма-фактор, контрол-ий гомеостатические ф-ии, и альтернативные сигма-факторы, активируемые специфич-ми сигналами / стрессовыми условиями. Только один σ-фактор обесп-ет транскрипцию всех жизненно важных генов, обеспеч-их гомеостат-ие клеточные процессы (репликацию ДНК, транскрипцию, трансляцию и т.д.). Этот сигма-фактор называют основным, а все остальные – альтернативными.

Инактивация основного σ-фактора летальна, альтернативных, как правило, – нет. Послед-ти промоторов, опознаваемых альтернативными сигма-факторами, существенно различаются и, как правило, не м/б распознаны более чем одной сигма-субъед-ей.

Будучи глобальными регуляторами, сигма факторы, как правило, не детектируют изменение условий сами, а полагаются в этом на др. Б. Сигма-факторы обычно являются конечным либо (реже) промеж-ым звеном какого-либо регуляторного каскада. Именно поэтому сигма-факторы обычно сами подвержены регуляции, причем осущ-ся она м/т на транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях.

 

 

66. Общий стресс: регулон RpoS.
RpoS

Буква S в названии σs происходит от стационарной фазы роста, на протяжении которой этот фактор был впервые обнаружен. Затем присутствие этого сигма-фактора было обнаружено в других стрессовых условиях, и сейчас считается, что присутствие σs является свидетельством т.н. «общего стрессового ответа». Этот ответ наблюдается, когда клетка сталкивается с рядом стрессовых ситуаций, видимым признаком чего является снижение скорости роста вплоть до вхождения в стационарную фазу.

Голодание, повышение осмолярности среды или понижение pH, неоптимальная температура – эти и другие стрессовые воздействия могут индуцировать общий стрессовый ответ. Физиологические последствия общего стрессового ответа включают устойчивость к многим стрессовым воздействиям, накопление запасных питательных веществ, изменения структуры клеточной стенки (увеличение частоты кросс-сшивок в пептидогликане) и изменение морфологии клетки (уменьшение общего размера и укорачивание клеток – они становятся почти сферическими).

Когда клетки E. coli входят в стационарную фазу или испытывают ограничение в питательных веществах, у них индуцируется реакция общего стрессового ответа, главным регулятором которой является сигма-фактор RpoS, кодируемая геном rpoS, под контролем которого находится около 200 генов. Кроме ограничений в питательных веществах (фосфоре, азоте, углероде, аминокислотах) и голодания, общий стрессовый ответ индуцируется замедлением скорости роста, высоким осмотическим давлением, низким pH, резкими скачками температуры и окислительным стрессом.

Индукция RpoS осуществляется на нескольких уровнях рядом cis- и trans-регуляторных элементов, а сам регулон общего стрессового ответа во многом перекрывается с другими стрессовыми регулонами, что делает клетки готовыми к одновременному воздействию многих стрессовых факторов. К настоящему времени показано участие RpoS в транспозициях и индуцированных транспозициями хромосомных перестройках при голодании у E. coli и P. putida, хотя точная его роль в механизмах этих транспозиций пока не определена.

Многие гены регулона общего стрессового ответа нуждаются в (p)ppGpp- гуанозинполифосфатном нуклеотиде для своей индукции, таким образом, регулоны жесткого и общего стрессового ответа коиндуцируются и перекрываются.

 

67. Периплазматический стресс: регулон RpoE
rpoE

Рассмотрим принцип действия сигма-фактора E. coli, RpoE. Этот белок принадлежит к большому семейству ECF (extracytoplasmic factors) сигма-факторов. Свое название эти сигма-факторы получили в связи с их участием в регуляции экспрессии внецитоплазменных белков (периплазматических, внешней мембраны и секретируемых во внешнюю среду). Основная функция RpoE - обеспечивать синтез белков, ответственных за нормальный фолдинг (сворачивание) белков внешней мембраны, но, кроме того, RpoE усиливает транскрипцию генов теплового шока (путем активации еще oдного сигма-фактора, σ32), а у патогенных бактерий родственные сигма-факторы активируют гены вирулентности.

RpoE реагирует на белки внешней мембраны и периплазматические белки, утратившие нормальную конформацию. Но поскольку сигма-фактор, естественно, является цитоплазматическим, а сигнал для его активации находится в периплазме, должен быть какой-то переносчик сигнала между двумя клеточными компартментами. Эту функцию выполняет мембранный белок RseA. В отсутствие сигнала RpoE инактивирован путем связывания с RseA. Эта инактивация усиливается за счет взаимодействия RseA с периплазматическим белком RseB. При нарушениях внешней мембраны, предотвращающих нормальный фолдинг ее белков, RseB связывается с неправильно свернутыми белками, освобождая RseA. Это ведет к ослабеванию связи RseA с RpoE, а дополнительное взаимодействие неправильно свернутых белков с RseA окончательно освобождает RpoE, который связывается с РНК-полимеразой и активирует транскрипцию ряда генов. В число этих генов входят:

fkpA, кодирующий периплазматический шаперон (необходимый для нормального фолдинга периплазматических белков и белков внешней мембраны);

degP - периплазматическая протеаза, деградирующая ненормальные или неправильно свернутые белки;

rpoH - сигма-фактор, активирующий транскрипцию генов теплового шока;

собственный оперон rpoE rseABC;

гены вирулентности у ряда бактерий

Поскольку RpoE активирует транскрипцию своего собственного оперона, первоначальная индукция по механизму положительной обратной связи резко усиливается за счет дополнительного синтеза RpoE. А поскольку одновременно с RpoE происходит сверхпродукция негативных регуляторов RseA и RseB, вся система быстро выключается, как только периплазма оказывается очищенной от неправильно свернутых белков.

 

68. Температурный шок.
Условия окружающей среды, нарушающие экстрацитоплазматическое пространство грамотрицательных бактерий, состоящее из внутренней мембраны, периплазма и внешней мембраны, вызывают реакцию стресса клеточной стенки: одним из таких условий является температура, еще более высокая, чем та, которая индуцирует регулон теплового шока (45–50 °С). У E. coli существуют, как минимум, две системы стресса клеточной стенки, одна зависит от альтернативного сигма-фактора транскрипции σE, другая контролируется мембранной сигнальной гистидинкиназой CpxA. Эти два стрессовых ответа различны как в отношении спектров стрессорных факторов, на которые они отвечают, так и генов, которые они активируют: так, σE-ответ запускается в первую очередь неправильно свернутыми белками внешней мембраны, а CpxA-ответ – белками периплазма и внутренней мембраны.

Холодовой шок, с которым нередко приходится сталкиваться бактериям, вызывает несколько проблем на клеточном уровне: в первую очередь при снижении температуры ниже 20°С ингибируется трансляция на рибосомах, РНК и ДНК образуют стабильные вторичные структуры, кроме того, снижается текучесть мембраны. Именно этим негативным для клетки эффектам противодействует ответ холодового шока, в ходе которого индуцируется синтез белков CspA, CspB, CspG и CspI – ДНК- и РНК-связывающих белков, действующих как активаторы транскрипции или РНК-шапероны, препятствующие стабилизации вторичных структур РНК. По-следнее ведет к антитерминации транскрипции прочих белков холодового шока и к устранению вторичных структур РНК, препятствующих трансляции. Синтез других белков холодового шока обеспечивает активность рибосом даже при низких температурах, а сохранение оптимальной текучести мембраны достигается за счет увеличения содержания в ней ненасыщенных жирных кислот.

 

Тепловой шок является гомеостатическим ответом клетки на индуцированное стрессовыми условиями изменение конформации белков. Этот феномен свойственен всем организмам, и его молекулярный механизм практически идентичен у бактерий, архей и эукариот. При повышении температуры клетка начинает синтезировать т.н. белки теплового шока, к которым прежде всего относятся молекулярные шапероны (DnaK, GroEL) и АТФ-зависимые протеазы (Lon, ClpAP). Эти белки выполняют две основные функции - обеспечивают фолдинг (сворачивание в нативную конформацию) и деградацию поврежденных белков. Несмотря на полную противоположность этих двух функций результат их осуществления один - ликвидация поврежденных (и потенциально опасных для клетки) белков.