Особенности организации генов, участвующих в делении клеток и их функции.

Если говорить о гене, который является абсолютно необходимым для деления каждой бактерии, то единственный ген из известных в настоящее время соответствует этому определению - ftsZ (даже этот ген вероятно отсутствует в по крайней мере одной бактерии - недавно сиквенированный геном Chlamydia trachomatis не имеет узнаваемого гомолога ftsZ). Но ftsZ в

одиночку оказывается достаточным для деления только самых простых бактерий, например M. genitalium, живущих в идеальной богатой питательными веществами окружающей среде при постоянной температуре и

постоянном осмотическом давлении и следовательно не нуждающихся (и не имеющих) муреиновой клеточной стенки. Другие бактерии должны иметь дополнительные структуры, чтобы выживать в своих местообитаниях. Одна из этих дополнительных структур – муреиновая клеточная стенка, типичная для огромного большинства Eubacteria. Присутствие клеточной стенки немедленно создает серьезные проблемы при делении. Жесткой и находящейся под постоянным осмотическим давлением изнутри муреиновой клеточной стенке требуется набор белков для правильного разделения пополам при делении клетки без нарушения целостности структуры, и эти белки должны действует координированно с другими белками, необходимыми для деления как такового. ftsZ - ген клеточного деления, которому уделяется наибольшее внимание в последнее время, после обнаружения того, что его продукт образует кольцо на внутренней стороне цитоплазматической мембраны в центре клетки. Ген ftsZ, расположенный в кластере mra на 2.5 минуте хромосомной карты, кодирует наиболее многочисленный белок клеточного деления, который присутствует в количестве от 5,000 до 20,000 копий на клетку. FtsZ белок разделяет некоторое сходство последовательности с эукариотическими тубулинами,что согласуется с его слабой ГТФазной активностью. Недавнее определение кристаллических структур FtsZ и тубулина подтвердило, что трехмерные структуры этих белков очень похожи несмотря на низкий уровень сходства первичной последовательности. N-концевые ГТФ-связывающие домены этих белков являются фактически идентичными, и C-концевые домены также очень схожи, хотя гомология первичных последовательностей C-концевых доменов не детектируется. Функциональное сходство FtsZ с тубулинами подтверждается его способностью собираться in vitro в протофиламенты и мини-кольца, которые близко напоминают структуры, формируемые тубулином. Учитывая диаметр этих протофиламентов и диаметр клетки, количество FtsZ в клетке достаточно, чтобы образовать протофиламент, окружающий клетку 20 раз. Способность FtsZ полимеризоваться (димеризоваться), была недавно демонстрирована in vivo. В настоящее время считается, что сокращение кольца, образованного молекулами FtsZ, приводит к продвижению молекулярных машин, синтезирующих клеточную перегородку в месте деления. Формирование этого кольца является самым ранним видимым признаком деления и может быть обнаружено очень рано в клеточном цикле.

 

82. Регуляция клеточного цикла у Escherichia coli и Caulobacter crescentus.

Бактерия Caulobacter crescentus интересна в плане изучения клеточного цикла потому, что, по крайней мере на первый взгляд, клеточный цикл этой бактерии наиболее близок к эукариотическому: имеются четко выраженные G1, S и G2 периоды (у прокариот сложно пока говорить о М фазе); более того, в результате деления образуются неравноценные клетки (т.е. наблюдается некоторая дифференцировка) – одна из дочерних клеток имеет жгутик и аппарат хемотаксиса, а другая неподвижна и остается прикрепленной к субстрату. В подвижной клетке репликация ДНК и деление клетки полностью заблокированы (т.е. имеет место четко выраженная G1 фаза клеточного цикла, которой не наблюдается у быстро растущих энтеробактерий). Через некоторое время бактерия утрачивает свой единственный полярный жгутик (а вместе с ним и аппарат хемотаксиса) и на

этом же полюсе клетки формирует стебелек, которым прикрепляется к субстрату. Такое морфологическое изменение совпадает с инициацией репликации ДНК (началом S фазы). Во время этой фазы прикрепленная к субстрату клетка удлиняется и формирует новый жгутик на полюсе клетки,

противоположном стебельку. По завершении репликации ДНК хромосомы перемещаются к полюсам (фаза G2), за чем следует деление клетки. Таким образом, в каждом цикле деления два типа морфологически и физиологически различных типа клеток сменяют друг друга: подвижная неспособная делиться клетка и неподвижная (прикрепленная) способная к росту и делению. Очевидно, что такая четкая смена поведения клеток должна строго контролироваться, и некоторая информация об этом контроле имеется. Центральным регулятором клеточного цикла является белок CtrA, принадлежащий к уже хорошо нам знакомому классу регуляторов ответа. Этот белок контролирует синтез жгутиков, метилирование ДНК и ее репликацию, деление клетки. Контроль репликации ДНК осуществляется путем ее метилирования. CtrA активирует транскрипцию гена ccrM, кодирующего ДНК-метилтрансферазу, жизненно необходимую для роста C.

crescentus.

Клеточный цикл E.Coli:Процесс клеточного деления у прокариот включает следующие события в определенной очередности:
1) накопление «критической» клеточной массы; 2) репликация ДНК генома; 3) построение новой клеточной оболочки; 4) построение клеточной перегородки; 5) расхождение дочерних клеток. Некоторые из этих событий протекают одновременно, другие строго последовательно или вообще могут отсутствовать. Регуляция клеточного деления складывается из регуляции каждого из этих событий и организации их взаимодействия, при котором в клеточном делении устанавливается последовательность процессов и вырабатываются сигналы для инициации следующего по порядку процесса.
Накопление критической клеточной массы и репликация ДНК
Это необходимые подготовительные этапы собственно клеточного деления. Следует отметить, что размер клеток каждого микроорганизма, растущего сбалансированно в стандартных условиях, является достаточно постоянной величиной, чтобы служить одним из таксономических признаков. В.Д. Донаши даже ввел понятие элементарной клетки, т.е. наименьшей, возможной для данного микроорганизма. Таким образом, существуют механизмы, включающие процесс деления клетки при накоплении ее пороговой массы. Построение новой клеточной оболочки
Необходимо различать пролиферацию цитоплазматической мембраны и клеточной стенки и сегрегацию поверхностных структур.
При изучении пролиферации используют, как правило, синхронные культуры микроорганизмов и изучают включение меченных радиоизотопами соединений путем равновесного или импульсного введения этих соединений. Таким путем установлено, что включение белков в цитоплазматическую мембрану Escherichia coli и Bacillus subtilis следует сложной кинетике, свидетельствующей о запасании предобразованных белков в цитоплазме, в период подготовки клеточного деления и быстрой их мобилизации – в процессе построения клеточной перегородки. В период деления возрастает активность некоторых литических ферментов, участвующих в образовании «брешей» в предсуществующем каркасе клеточной стенки, необходимых для включения новых ее фрагментов. Таким образом, регуляция активности этих ферментов осуществляется путем временного перевода их в скрытое состояние с последующей мобилизацией в необходимый момент. Точных данных о механизмах такой регуляции нет, но можно полагать, здесь имеет место взаимодействие ферментов с мембранами.

 

 

83 Споруляция.
.Одной из особенностей микроорганизмов является их способность к спорообразованию. Споры образуются при неблагоприятных условиях существования (высушивание, недостаток питательных веществ, изменение рН среды и т. д.), причем из одной клетки формируется только одна спора. Таким образом, образование спор не связано с процессом размножения, а является своеобразным приспособлением к переживанию в неблагоприятных условиях. По принятой номенклатуре спорообразующие аэробы носят название бацилл, а спорообразующие анаэробы — клостридии. Процесс спорообразования проходит ряд стадий, в течение которых в определенном месте клетки цитоплазма, нуклеоид, рибосомы концентрируются, уплотняются, покрываются мембраной, а затем плотной, плохо проницаемой многослойной оболочкой, включающей кальциевые соли дипиколиновой кислоты, обусловливающей термоустойчивость спор. Споры длительное время могут сохраняться в покое, оставаясь жизнеспособными. Так, в почве споры патогенных микроорганизмов (возбудителя сибирской язвы, столбняка и др.) могут сохраняться десятками лет. При попадании в благоприятную среду споры очень быстро прорастают — из 1 споры возникает 1 бактериальная клетка, которая начинает размножаться. Спорообразование — видовое свойство палочек, а форма и расположение формирующейся споры по отношению к вегетативной части клетки является дифференциально-диагностическим признаком.Форма спор может быть овальной или круглой, расположение центральное (возбудитель сибирской язвы), субтерминальное— ближе к концу палочки (возбудители газовой гангрены, ботулизма) итерминальное — на конце (возбудитель столбняка).В зрелой споре различимы: центральный, плохо окрашиваемый участок (спороплазма), двухслойная ЦПМ и оболочка споры.Спороплазма (протопласт споры) включает цитоплазму, бактериальную хромосому, системы белкового синтеза и некоторые другие (например, анаэробного энергообразования).Оболочка споры двухслойная: пространство между слоями заполняют гликопептидные полимеры, сходные с пептидогликанами, образующие сетчатую структуру (кортекс), проявляющую высокую чувствительность к лизоциму. Внутренний слой (стенка споры) образован пептидогликанами, аналогичными таковым \ вегетирующей клетки. Внешний слой (собственно оболочка) образуют кератиноподобные белковые структуры с низкой проницаемостью.Процесс споруляции (спорообразования) начинается сразу после возникновения дефицита питательных веществ и продолжается приблизительно 8 ч. Никаких внешних источников питания или энергии при этом не требуется. Споруляцию стимулирует внесение в среду глюкозы, фосфора и NH4; угнетает внесение пептона, лактозы, NaCl, CaCl2(у бактерий рода Bacillus— DL-аланина).

84. Механизм принятия решения о начале споруляции
Бактерии достаточно сложно принять решение о начале споруляции, поскольку этот процесс, будучи запущенным, уже необратим. А поскольку это решение коренным образом меняет метаболизм клетки, ошибка может иметь для нее печальные последствия. Поэтому для принятия этого решения

бактерия должна проанализировать множество сигналов от внешней среды от внутриклеточных метаболических систем, от клеточного цикла. Сигналы могут происходить от нехватки питательных веществ, плотности популяции, синтеза ДНК, повреждений ДНК, цикла Кребса. Все эти сигналы интегрируются на уровне одного регуляторного белка (Spo0A). Сигналы передаются на Spo0A в виде его фосфорилирования через цепь переносчиков фосфата. Spo0A принадлежит к классу регуляторов ответа из семейства двухкомпонентных регуляторных систем, которые вам уже хорошо знакомы. И той информации, ктотрой вы уже обладаете, наверное, достаточно, чтробы сделать вывод о том, что в данном случае сложно будет обойтись простой двукомпонентной системой. И действительно, основу регуляторной системы споруляции составляет сложная разветвленная фосфотрансляционная сеть. В

качестве источника сигнала могут выступать несколько сенсорных белков (гистидинкиназ), сигнал от которых (фосфат) поступает на ключевой регулятор через несколько переносчиков. Такая сложная система создает много точек, в которых можно осуществлять контроль передачи сигнала, что позволяет тесно координировать многие клеточные события. Поэтому практически каждая стадия передачи сигнала по фосфотрансляционной сети в той или иной степени подвержена регуляции. Фосфат в сигнальную фосфотрансляционную систему поступает от двух сенсорных киназ,

цитоплазматической KinA и мембранной KinB, а в качестве получателей этого фосфата выступают два РО. Первый из них, Spo0F непосредственнно фосфорилируется киназами, тогда как фосфат на второй РО, Spo0A, попадает от Spo0F через переносчик Spo0B. Spo0A~Ф является транскрипционным

фактором и выступает в роли репрессора либо активатора по отношению к тем генам, чьи функции являются критическими при переключении клетки с вегетативного роста на споруляцию. Один из таких генов кодирует репрессор AbrB, который предотвращает экспрессию ряда генов, необходимых при

переключении на споруляцию. Накопление Spo0A~Ф в клетке снижает уровень AbrB и активирует ранние гены споруляции. Кроме того, Spo0A~Ф является непосредственным активатором генов и оперонов, таких как spoIIA и spoIIG, кодирующих сигма факторы σ F и σ Е, ответственные за локальную

экспрессию генов споруляции соответственно в преспоре и материнской клетке.

85.. Споруляция у Bacillus subtilis: каскадная активация альтернативных сигма-факторов на разных стадиях споруляции
Процесс споруляции у Bacillus subtilis прох-ит ч-з серию четко выраж-ых -их стадий, и его результ явл-ся превр-ние растущей кл-ки в двухкамерный спорангий, в котором и форм-ся спора. Изв-но более 125 генов, участв-их в этом процессе. Их транскрипция контр-ся во времени и пространстве 4-мя ДНК-связываю-ми белками и 5 сигма факторами, а сигнал для запуска всего процесса поступает от сенсорных систем и путем переноса фосфатной группы по сложной фосфотрансляционой сети.

Стадии споруляции: