Основные субпопуляции клеток,

УЧАСТВУЮЩИХ В ИММУННЫХ РЕАКЦИЯХ

 

Типы клеток	Поверхностные маркеры	Свойства
Т-лимфоциты	СD3	Участие в клеточных и гуморальных иммунных реакциях, регуляции иммунного ответа
Т-хелперы	СD4	Распознавание антигена в комплексе с HLA-D; стимуляция дифференцировки В-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфо-цитов; активация макрофагов
Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ)	СD8	Распознавание антигена в комплексе с HLA-A,B,C; уничтожение клеток, экспрес-сирующих антигены
В-лимфоциты	CD19, CD20, CD22, Ig, C3R	Распознавание антигена; дифференциров-ка в плазматические клетки, секретирую-щие антитела; презентация антигена
Естественные киллеры (ЕК)	CD16, CD56	Распознавание антигена в комплексе с CD56; уничтожение клеток, экспресси-рующих антигены; антителозависимая цитотоксичность; регуляция иммунного ответа
Макрофаги (фагоцитирующие клетки моноцитарного ряда)	CD16, HLA-D, FcγR, C3R	Фагоцитоз, уничтожение микроорганиз-мов и опухолевых клеток; презентация антигена; регуляция иммунного ответа
Нефагоцитирующие клетки моноцитарного ряда, дендритные клетки	HLA-D, FcγR, C3R	Презентация антигена

ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ

Распознавание антигена IgD

Первичный им- IgM

Мунный ответ

Вторичный им- IgG, A, E ГНТ (гиперчувствительность

мунный ответ немедленного типа)

Секреторный им- IgA Реагиновый IgE

Мунный ответ тип

Комплементзависимый IgG

Тип

Иммунокомплексный IgG

Тип

Элиминация антигена, препятствие для его распространения в организме (фиксация на клетках), запоминание антигена

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ,

СВЯЗАННЫЕ С Fc-ФРАГМЕНТОМ

Функции иммуноглобулинов	Изотипы иммуноглобулинов
IgD	IgM	IgG1	IgG2	IgG3	IgG4	IgA	IgE
Активация компле-мента по классичес-кому пути	-	+++	++	+	+++	-	-	-
Активация компле-мента по альтерна-тивному пути	-	-	-	-	-	-	+	-
Преодоление плацен-тарного барьера, др. тканевых барьеров	-	-	+	+	+	+	-	-
Постоянная фикса-ция на мембране В-лимфоцита	+++	+	-	-	-	-	-	-
Присоединение к фа-гоцитам (нейтрофи-лам и макрофагам)	-	-	+++	+	+++	+	+	-
Присоединение к туч ным клеткам (базо-филам,эозинофилам)	-	-	-	-	-	+	-	+++

ОСНОВНЫЕ ЦИТОКИНЫ, ПРИНИМАЮЩИЕ УЧАСТИЕ

В ИММУННОМ ОТВЕТЕ

Цитокин	Источник	Мишень	Эффекты
ИЛ-1	Макрофаги, В-клетки, ЕК	Т-клетки, В-клетки, макрофаги	Активация лимфоцитов и макрофа-гов, гипертермия, острофазная реак-ция, усиление клеточной адгезии
ИЛ-2	Т-клетки	В-клетки, Тх, ЕК, макрофаги	Активация лимфоцитов и макрофа-гов, стимуляция секреции цитокинов
ИЛ-3	Т-клетки	Стволовые клетки	Пролиферация
ИЛ-4	Т-клетки	В-клетки, мак-рофаги	Пролиферация лимфоцитов, актива-ция макрофагов, переключение син-теза Ig: продукция IgG1 и IgE, подавление IgG2 и IgG3
ИЛ-5	Т-клетки	В-клетки, ство-ловые клетки	Пролиферация, дифференцировка, синтез IgA, эозинофилия
ИЛ-6	Макрофаги	В-клетки, макрофаги	Пролиферация, стимуляция секре-ции Ig, острофазная реакция
ИЛ-10	Т-клетки	Т-клетки	Пролиферация
α-ФНО	Макрофаги, Т-клетки,ЕК	В-клетки, макрофаги	Рост и дифференцировка. активация, усиление адгезии
β-ФНО	Т-клетки	Опухоль	Цитотоксичность
Перфорин	ЦТЛ	Опухоль	Лизис
МИФ	Тх1	Макрофаги	Подавление миграции

 

 

ОСНОВНЫЕ ОБЪЕКТЫ И ТЕСТЫ ОЦЕНКИ ИММУННОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА

Оценка состоя- Оценка состоя- Оценка наличия Оценка аллерги-

ния клеточного ния гуморального гуморальной ре- ческого статуса

Иммунного ответа иммунного ответа акции на антиген

Т-лимфоциты В-лимфоциты, Т- Антитела сыворот- IgE-антитела, ЦИК,

И их субпопу- хелперы, макро- ки крови и прочих фактор угнетения миг-

Ляции, ЕК, ци- фаги, гранулоци- биологических суб- рации лейкоцитов,

Токины: ин- ты, комплемент, стратов, фагоцитоз внутрикожные, накож-

Терлейкин-2, иммуноглобули- микробов ные пробы, дегрануля-

Интерферон ны ция базофилов

Функционирование иммунной системы, как и любой другой, может нарушиться. О состоянии иммунной системы организма человека можно судить на основании оценки количесва и функциональной активности иммунокомпетентных клеток и других факторов иммунитета, а именно фагоцитоза, системы комплемента. Как известно, нарушения иммунитета, прежде всего, проявляются в развитии иммунодефицитных состояний, которые бывают первичными (генетически детерминированными) и приобретенными, или вторичными (например, СПИД). Под вторичными иммунодефицитами подразумевают такие нарушения иммунной системы, которые возникают через определенный промежуток времени после рождения и развитие которых связано с воздействием на организм какого-то повреждающего фактора. Вторичные иммунодефициты могут развиваться как у детей, так и у взрослых и быть следствием нарушения как факторов естественной резистентности, так и специфического иммунитета. Эти нарушения проявляются в развитии острых и хронических инфекционных процессов. В иммунологических исследованиях чаще всего применяется изучение фагоцитоза, клеточного и гуморального иммунитета. Для этого разработаны и внедрены в клиническую практику различные иммунологические тесты, рутинные и современные.

• Методы розеткообразования с нативными (Т-лф) или нагруженными антителами и С3 (В-лф) эритроцитами барана, мыши (В-лф).
• Метод проточной цитофлуориметрии.
• Иммуноферментный метод с CD-маркерами: CD3 (Т-лф), CD4 (Т-хелперы), CD8 (Т-цтл), CD22 (В-лф), CD16 (ЕК, мф).
• Реакции бласттрансформации с митогенами (CD4, CD8, B-лф).
• Цитотоксические тесты (ЕК-активность, Т-цтл-активность).
• Определение уровня отдельных цитокинов в сыворотке крови.
• Определение уровня иммуноглобулинов методом радиальной диффузии.
• Определение фагоцитарных показателей и НСТ-тест.
• Определение уровня комплемента и его компонентов в сыворотке крови.
• Серологические реакции.
• Реакции торможения миграции лейкоцитов и дегрануляции базофилов.
• Определение уровня IgE радиоиммунным или иммуноферментным методом, определение уровня ЦИК центрифугированием с полиэтиленгликолем.
• Кожные аллергические пробы.

Определение субпопуляций лимфоцитов. Фенотипическая характеристика клеток лимфоидно-макрофагального ряда. Одним из наиболее распространенных приемов фенотипической идентификации субпопуляций лимфоцитов является определение их поверхностных структур - антигенов и рецепторов. Среди таковых различают структуры, определяемые только на поверхности Т-лимфоцитов, только на поверхности В-лимфоцитов и структуры, определяемые на поверхности как Т-, так и В-лимфоцитов и других представителей субпопуляций лимфоидных и вспомогательных клеток. Введение в практику иммунологии моноклональных антител (МКА) открыло новые возможности для точного выявления субклассов лимфоцитов, несущих различные мембранные антигены, а так же для изучения их субмикроскопической организации, взаимосвязи между структурой и функцией и определения количества лимфоидных клеток. Что же касается самой методики фенотипирования с участием моноклональных антител, то она чаще всего осуществляется либо путем проточной цитофлуориметрии, либо с использованием различных модификаций иммуноферментного метода. Развитие представлений о субпопуляционной организации клеток иммунной системы шло в двух направлениях. Одно из них связано с вычислением и детализацией все новых субпопуляций, различающихся функциональными свойствами. Другое направление базируется на поиске новых дифференцировочных антигенов, экспрессирующихся на поверхности лимфоцитов на определенных стадиях их созревания. При этом предполагалось, что в конечном итоге удастся создать такую картину субпопуляционной структуры, когда каждая субпопуляция будет характеризоваться только ей присущими антигенами. В настоящее время более вероятной рассматривается модель, при которой дифференцировочные антигены могут встречаться на различных функциональных субпопуляциях, и уникальной для конкретной субпопуляции может считаться только комбинация антигенов. С помощью МКА открыто и охарактеризовано боле 90 антигенов лимфоцитарных клеток человека. При этом МКА имеют множество систем маркировок. В настоящее время используются панели МКА серий ИКО (ВОНЦ АМН РФ), соответствующие международным стандартам, ЛТ и ЛВ (Институт иммунологии Минздрава РФ), ВСА (ВГНЦ АМН РФ), МКА к тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов человека (ВКНЦ АМН РФ и ЦНИИРРИ Минздрава РФ), ИПО (Институт проблем онкологии Украины). Международная система маркировки моноклональных антител СD (от Сlusters оf Differentiation) была принята и утверждена на конференциях в Париже (1982), Бостоне (1984), Оксфорде (1986), Вене (1989). Среди антигенов, представленных на клеточной поверхности Т-лимфоцитов человека, принято выделять три группы: “пан-Т- клеточные”, субпопуляционные и активационные. К первой группе относятся антигены CD2, CD3, CD5, CD6 и CD7, выявляемые на всех или почти всех Т-клетках.

Из второй группы субпопуляционных маркеров наиболее известны CD4 и CD8 антигены, с помощью которых измеряется соотношение CD4+/CD8+, а последнее является чувствительным индикатором нарушений иммунного статуса. По многочисленным наблюдениям, число клеток, экспрессирующих антигены зрелых Т-клеток CD3, составляет 53,9%, около 50% тимоцитов экспрессировало на мембране антигены CD4 и CD8, причем суммарное их число было существенно больше, чем количество CD3-тимоцитов, что подтверждает данные о наличии на мембране большей части тимоцитов обоих маркеров.

Антиген СD4, экспрессируется на 70-80% тимоцитов, 60% Т-клеток периферической крови. Антиген CD8 представлен на 80-90% тимоцитов, 25-35% циркулирующих Т-клеток. Антигены CD4 и CD8, маркирующие Т-лимфоциты, принято связывать с Тh и Тs/ctl соответственно. Эта связь первоначально понималась прямолинейно, но в настоящее время CD4 и CD8 рассматриваются в контексте наличия одного из классов HLA, участвующего в распознавании номинального антигена Т-лимфоцитом.

На всех этапах дифференцировки В-клеток экспрессированы антигены CD19, CD20, CD22, CD29. В цитоплазме В-клеток антиген CD22 появляется одновременно с поверхностной экспрессией антигена CD19, а на зрелых В-клетках этот антиген экспрессирован на поверхностной мембране.

Говоря о процессах активации лимфоцитов при реализации их участия в иммунном ответе, особо следует остановиться на антигенах системы HLA.

Антигены HLA являются антигенами гистосовместимости и подразделяются на классы. Антигены 1 класса (HLA-A,-B,-C) выявляются на поверхности всех клеток, относятся к категории серологически определяемых (SD). Молекулы гистосовместимости I класса экспрессируются почти всеми ядросодержащими клетками организма человека, кроме клеток нейроглии и трофобластов. Сравнительно недавно в состав семейства генов HLA-комплекса были описаны гены HLA-E,-F,-G, получившие название неклассических HLA-генов I класса.

Антигены HLA класса II (HLA-DR,-DQ,-DP) экспрессируют В-лимфоциты, антигенпрезентирующие клетки (моноциты, макрофаги) и активированные Т-лимфоциты. Эти антигены участвуют в процессах распознавания антигена, стабилизации антигенсвязывающих рецепторов Т-лимфоцитов, активации Т- и В-лимфоцитов, играют важнейшую роль в дифференцировке Т-лимфоцитов, селективной экспансии тимоцитов, специфичных для аутологичных антигенов HLA II класса.

ЕК-клетки, относящиеся к БГЛ, в отличие от остальных лимфоидных клеток, не рестриктированны по HLA. Что касается фенотипической характеристики, ЕК несут на своей поверхности CD16 и CD56.

ОЦЕНКА ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА

Определение уровня иммуноглобулинов является очень важным при диагностике и клиническом мониторинге иммунодефицитов, моноклональных гамма-тий, аутоиммунных заболеваний и других патологических состояниях.

IgG является особенно активным против грамотрицательных бактерий, токсинов и вирусов. С помощью IgG-антител (AT) микробы и чужеродные клетки агглютинируются и лизируются. Комплемент взаимодействует с СН1 и СН2-доменами IgG. С помощью СН2 и СНЗ-доменов IgG взаимодействует с Fc-рецептором макрофагов, моноцитов, нейтрофилов, киллеров и клеток плаценты.

Поскольку только IgG способен проникать через плаценту, новорожденные из всех материнских иммуноглобулинов имеют только IgG. Снижение его концентрации и полное исчезновение наблюдается к четырем месяцам жизни. Далее уровень IgG повышается за счет собственной иммунной системы ребенка, достигая уровня взрослых к восьми годам жизни. Считается, что IgD является только рецепторным иммуноглобулином В-лимфоцитов и сывороточный IgD является результатом сбрасывания рецепторного IgD с В-клет-ки при их активизации. В настоящее время накапливаются данные, что IgD может местно синтезироваться в подслизистых оболочках слюнной железы и т.д. Иными словами, так же как IgA, этот класс иммуноглобулинов выполняет определенную роль по защите слизистых оболочек от инфекционных агентов. Увеличение Ig M свидетельствует о первичном иммунном ответе. Уменьшение встречается либо при иммунодефицитом состоянии, либо при активации фагоцитоза в организме. Количество Ig G увеличивается при вторичном иммунном ответе, аутоиммунных заболеваниях, вирусных, токсических и многих других инфекционных заболеваниях, возбудители которых имеют крупныеразмеры (протозойные инфекции, глистные инвазии и др.). Уменьшение Ig G наблюдается при иммунодефиците, чаще всего у детей, бактерионосительстве, хронических инфекциях, аутоиммунных заболеваниях и сывороточной болезни.

Увеличение Ig Aговорит о местном характере инфекционного процесса. Дефицит Ig Aвстречается, как правило, у людей с хроническим течением заболевания.

Определение иммуноглобулинов в сыворотке крови. Концентрации иммуноглобулинов классов М, G, А в сыворотке крови, а также IgA и S-компонентов в слюне и других секретах являются важнейшими параметрами гуморального звена иммунной системы. Методы оценки количества иммуноглобулинов в биологических средах, которые могут быть применены при обследованиях больных, можно разделить на несколько групп в соответствии с принципами, лежащими в их основе: иммунопреципитация в геле, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) и радиоиммунный анализ (РИА). Все эти методы основаны на сравнении концентрации иммуноглобулинов в исследуемом объекте со стандартным раствором установленной концентрации. До настоящего времени наибольшее распространение получили методы иммунопреципитации в геле по Манчини, в силу, прежде всего своей доступности, достаточной чувствительности и точности. Сущность этого метода заключается во взаимодействии антиглобулиновой сыворотки М или G, или А с исследуемой сывороткой. При наличии специфической связи между антителами антиглобулиновой и испытуемой сыворотками на месте взаимодействия реагентов образуется преципитат в виде мутного кольца в геле

Радиоиммунным анализом (РИА) определяют, например иммуноглобулины E. Для этой цели используют полихлорвиниловые лунки, которые заполняют исследуемой сывороткой. Иммуноглобулины этой сыворотки, выступающие в роли антигена, прилипают к стенкам лунки. Через 12 ч вторым слоем в лунки наносят антиглобулиновую сыворотку E, меченную радиоактивным йодом I_131. Затем лунки промывают и считают радиоактивность. По степени радиоактивности судят о количестве иммуноглобулинов.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Данная реакция основана на взаимодействии специфических антител антиглобулиновой сыворотки, которые несут на себе ферментную метку – пероксидазу хрена, с глобулинами исследуемой сыворотки. В результате этого взаимодействия образуется иммуноэнзимный комплекс антиген-антитело, выявляемый цветной реакцией при добавлении соответствующего субстрата.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) - ставится таким образом, что к взвеси лимфоцитов в питательном растворе добавляется в разных дозах неспецифический митоген – вещество, стимулирующее бласттрансформацию. В качестве митогена используются либо фитогемагглютинин (ФГА) или конканавалин (КонА), избирательно стимулирующие Т-клетки, либо бактериальный липополисахарид (ЛПС), избирательно стимулирующий В-клетки. На специфические антигены в РБТЛ реагируют лишь лимфоциты, предварительно к ним сенсибилизированные. Оценка РБТЛ проводится в динамике микроскопическим и радиометрическим методами.

Реакция подавления миграции лейкоцитов (РПМЛ) основана на способности гранулоцитов и моноцитов крови, а также тканевых макрофагов, к свободной миграции, которая тормозится под действием лимфокинов. Миграцию лейкоцитов и ее торможение под действием лимфокинов изучают в специальных капиллярах или на стекле под слоем агарозы. Результаты торможения миграции оценивают по ограничению зоны распространения лимфоцитов в сравнении с контролем.

 

ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА

Как известно, попадание в организм антигена вызывает, по крайней мере, два вида иммунного ответа: клеточный и гуморальный. Под клеточным иммунитетом подразумевают способность CD4 Т-лимфоцитов распознавать специфический антиген, находящийся на антиген-представляющих клетках и реагировать на него синтезом ряда цитокинов, ведущих к образованию антиген-специфических СD4 и CD8 Т-киллеров, эффекторов гиперчувствительности замедленного типа и активации клеток моноцитарно-макрофагальной системы. Под гуморальным иммунитетом подразумевают синтез специфических иммуноглобулинов активированными В-лимфоцитами, в результате их активации антигеном, находящимся на антиген-представляющих клетках, и цитокинами, продуцируемыми CD4 Т-лимфоцитами. Т-лимфоцит, и особенно CD4- клетка, является центральной фигурой иммунного ответа, определяющей характер иммунного ответа, его интенсивность и продолжительность. Поэтому количественное определение Т-лимфоцитов и их субпопуляций, идентификация продуцируемых цитокинов и выявление способности осуществлять эффекторные функции лежат в основе изучения клеточного иммунитета.

В клинической иммунологии для его оценки применяется сравнительно большой набор иммунологических тестов:

- определение гиперчувствительности замедленного типа с помощью кожных проб;

- определение пролиферативного ответа к Т-митогенам, аллоантигенам;

- определение различных субпопуляций лимфоцитов;

- уровень гормонов тимуса;

- уровень секретируемых цитокинов;

- тест ингибирования миграции лейкоцитов.

Кожные тесты. Кожные тесты являются аналогомтуберкулиновых проб. Так как эти реакции опосредуются Т-лимфоцитами, то в качестве антигенов выбираются только Т-зависимые антигены, как например, вирус свинки, очищенный белковый дериват (БД), кандида, дифтерийный или столбнячный анатоксин, трихофитон.

Указанные антигены вводятся интрадермально, и учет реакции осуществляют по величине воспалительного очага (до определенного размера, например до 1см) через 24-48 часов. В известном смысле данный тест является интегральной реакцией, оценивающей несколько этапов иммунного ответа: распознавание антигена, хемотаксис, синтез цитокинов. Главной трудностью при проведении этого теста является трудность стандартизации воспалительной реакции.

Фирма "Merieux" разработала специальный пластиковый аппликатор для постановки кожных проб. Аппликатор содержит на своей поверхности восемь головок. На поверхности каждой головки находится девять рядов зубцов общей площадью 2 мм². Зубцы каждой головки погружены в плановые чашечки, содержащие различные антигены. В аппликаторе используются семь антигенов: столбнячный, дифтерийный, стрептококковый, кандидозный, протейный, антиген трихофитона и туберкулин.

Определение пролиферативного ответа лимфоцитов. Определение пролиферативного ответа лимфоцитов периферической крови является важнейшим показателем функциональной активности этих клеток. В качестве поликлональных Т-митогенов используются фитогемагглютинин

(ФГА), конканавалин А (КонА), митоген лаконоса, а также аллогенные клетки. В качестве специфических антигенов применяются чаще всего кандидозные антигены, стрептокиназа-стрептодорназа, дифтерийный и столбнячный анатоксины, т.к. большинство людей в прошлом имели с ними контакт. Некоторые Т-митогены, которые традиционно используются в клинической иммунологии, имеют тенденцию реагировать с различными субпопуляциями Т-клеток: КонА преимущественно индуцирует Т-супрессоры, Т-хелперы синтеза иммуноглобулинов. При использовании аллогенных клеток пролиферативный ответ связан с распознаванием Т-лимфоцитами антигенов второго класса гистосовместимости на аллогенных В-клетках и моноцитах, т.е. эта реакция включает в себя все основные этапы иммунного ответа. При оценке результатов пролиферативного ответа на Т-митогены следует учитывать, что эти агенты являются поликлональными стимуляторами и положительный результат говорит только о том, что регулирующие клетки в организме существуют и могут давать адекватный ответ на соответствующий стимул.

Определение уровня секретируемых цитокинов (интерлейкинов – IL). В последнее время стало ясно, что два вида иммунного ответа — клеточный и гуморальный — регулируются двумя субпопуляциями CD4 Т-лимфоцитов: Т-хелперами 1 и Т-хелперами 2 (Th1 и Th2). Эти субпопуляции Т-хелперов синтезируют различные наборы цитокинов, которые и определяют характер развития ответа. Th1 продуцируют цитокины, которые ведут к развитию клеточного иммунитета, Th2 продуцируют цитокины, которые ведут к развитию гуморального иммунитета. Все или почти все эффекторные и иммунорегуляторные функции Т-лимфоцитов опосредуются продуцируемыми ими цитокинами. Цитокины Th2 обеспечивают развитие гуморального иммунитета к Т-зависимым антигенам, что важно в защите организма от пиогенных инфекций. Вместе с тем цитокинам этой субпопуляции принадлежит важная роль в развитии аллергических реакций. IL-4 ответствен за активацию синтеза IgE. IL-5 участвует в разви­тии эозинофилии. Комбинация из IL-3, IL-4 и IL-10 активирует процесс образования тучных клеток. Таким образом, оценивая цитокины, клинический иммунолог более детально интерпретирует данные о развитии и качестве иммунного ответа.