Принципы транскрипционной регуляции

Промоторы эукариот: размеры, положение, структура и механизм распознавания различными РНК-полимеразами.

В соответствии с биохимическими критериями промотор представляет собой последовательность нуклеотидов, обеспечивающую базальный (но не максимальный) уровень транскрипции соответствующего транскриптона. Он является той минимальной последовательностью, которая специфически распознается холоферментом РНК-полимеразы среди случайных последовательностей нуклеотидов.

Бактериальный промотор содержит две канонические последовательности: в области -35 и в области -10.

Промотор эукариотических генов, узнающийся РНК-полимеразой промотор содержит два базовых регуляторных элемента: ТАТА-последовательность (положение -25) и специфическую нуклеотидную последовательность, обогащенную пиримидинами в положении -75.

Основной элемент промотора - место связывания РНК-полимеразы, которое она занимает перед началом синтеза РНК. В состав промоторов могут входить также участки связывания белков-регуляторов.

У эукариот регуляторные элементы собраны в регуляторные регионы. Основной регуляторный элемент эукариот – это коровый (базальный) промотор. Он обеспечивает сборку базального транскрипционного комплекса (из основных факторов транскрипции и РНК-полимеразы) и инициацию транскрипции на базальном (исходном, базовом) уровне. Часто этот уровень так низок, что приводит к синтезу лишь единичных молекул РНК и, в дальнейшем, белков.

 

Промоторные элементы, контролирующие точку инициации и интенсивность транскрипции.

Промоторы, узнаваемые РНК-полимеразой II, содержат три различных семейства регуляторных последовательностей ДНК. Последовательности первого семейства включают так называемые коровые, или базальные элементы промотора, расположен­ные вблизи точки инициации транскрипции. В настоящее время известны два класса базальных элементов: TATA-последовательность, расположенная за 25–30 нуклеотидов до точки инициации (каноническая последовательность – TATAa/tAa/t), и так называемый инициатор (Inr), последовательность которого обогащена пиримидинами. Элементы TATA-последовательности и инициатор необходимы для сборки ДНК-белкового инициационного комплекса и распознаются основными факторами тран­скрипции. Промоторы РНК-полимеразы II содержат один или оба регуляторных элемента или же не имеют их вообще. При этом оба элемента могут функционировать независимо друг от друга или же в их действии наблюдается синергизм.

К двум другим классам цис- регуляторных промоторных элементов у эукариот относятся последовательности, расположен­ные вблизи промотора (от 50 до нескольких сотен пар оснований перед точкой инициации), а также дистальные элементы (эн­хансеры и сайленсеры), расстояние которых от промотора может превышать 60 т.п.о. Оба класса таких последовательностей со­держат сайты связывания регуляторных белков, модулирующих транскрипцию.

У некоторых промоторов, в частности ассоциированных с генами домашнего хозяйства, может отсутствовать явно выраженная TATA-последовательность. Проксимальные и дистальные регуляторные элементы промоторов построены из коротких транскрипционных элементов длиной в 10–15 п.о., с которыми непосредственно взаимодействуют фак­торы транскрипции. Проксимальные регуляторные элементы, как правило, имеют простую структуру, включающую один или не­сколько транскрипционных элементов (ТЭ).

 

 

Транскрипционный контроль

Регуляторная часть гена эукариот включает цис-регуляторные элементы (промотор, который граничит с открытой рамкой считы­вания гена) и транс- регуляторные элементы (энхансеры, сайленсеры, аттенюаторы и инсуля­торы) которые расположены далеко от кодирующей части гена (на расстоянии миллионов пар нуклеотидов).

В составе генов эукариот есть много регуляторных элементов. Для генов, которые экспрессируются конститутивно (то есть с постоянной скоростью), достаточно лишь наличие участков для связывания общих факторов транскрипции. Для генов, скорость экспрессии которых изменяется, существуют участки, связывающие регуляторные белки (специфические факторы транскрипции, репрессоры).
К активирующим элементам генома принадлежат: энхансеры (усилители транскрипции) – участки ДНК (мотивы, модули), кото­рые содержат несколько десятков пар нуклеотидов и расположены на значительном расстоянии от регулируемого ими гена, находясь спереди или сзади промотора, или в составе интронов. Связывание с энхансером соответствующих регуляторных бел­ков усиливает в десятки и сотни раз процесс транскрипции. Среди регуляторных последовательностей выделяют так называемые элементы ответа, то есть энхансеры, общие для группы генов. Благодаря, этому один гормон, связавшись с одним регуляторным белком, может активировать несколько генов.
Некоторые энхансеры после связывания с определенными белками не усиливают, а наоборот, блокируют транскрипцию генов, тогда они называются сайленсерами, или ослабляют транскрипцию, тогда они называются аттенюаторами. Они обеспечивают так называемое генетическое молчание, или сайленсинг. Благодаря сайленсингу организм может выключать из работы те гены, ко­торые ему на этом этапе не нужны. Это явление имеет место во время дифференциации клеток.
Известны также и инсуляторы или изоляторы - регуляторные элементы ДНК, которые отвечают за блокировку взаимодействия между энхансером и промотором. Действие инсулятора обеспечивается присоединением к нему специальных инсуляторных белков. Потребность в инсуляторе возникает тогда, когда активируется энхансер общий для группы генов, а активация одного гена из этой группы является нежелательной.

 

 

14. Стадии инициации транскрипции.

Инициация транскрипции — сложный процесс, зависящий от последовательности ДНК вблизи транскрибируемой после­довательности и от наличия или отсутствия различных белковых факторов.

Инициация транскрипции начинается со сборки на промоторе прединициационного комплекса, в состав которого входят молекулы РНК-полимеразы и матричной ДНК. Если в случае РНК-полимеразы E. coli и других прокариот для осуществления этого процесса нет необходимости в присутствии других белковых факторов, то механизм сборки инициационного комплекса с уча­стием РНК-полимеразы II носит более сложный характер. В настоящее время существуют две модели инициации транскрипции РНК-полимеразой II. В соответствии с одной из них на промоторе происходит постепенная (ступенчатая) сборка инициационного комплекса из отдельных компонентов. Другая модель акцентирует внимание на то, что Pol II может входить в состав инициаци­онного комплекса в виде холофермента, состоящего из многих субъединиц. Сборка такого комплекса начинается с последовательного связывания с промотором основных факторов транскрип­ции. Обычно факторами транскрипции называют белки или белковые комплексы, непосредственно не участвующие в каталитическом акте образования РНК, но необходимые для прохождения основных этапов транскрипции и ее регуляции. По функциональному признаку принято различать три класса факторов транскрипции. К первому классу относятся основные фак­торы транскрипции, обеспечивающие нерегулируемый базальный уровень транскрипции и функционирующие в клетках всех типов.

Ко второму классу относятся факторы транскрипции, специфически взаимодействующие с опре­деленными последовательностями ДНК, которые являются основ­ными регуляторами транскрип­ции и обеспечивают тканеспецифическую экспрессию генов. И, наконец, третий класс факторов 14транскрипции (в том числе много­численные TAF-белки (TAB-associated factors)) представлен недавно открытыми белками – коактиваторами транскрипции, которые действуют согласо­ванно с основными и тканеспецифическими факторами, обеспечивая более тонкую регуляцию транскрипции.

 

 

Понятие о регулоне.

Некоторые группы структурных генов объединены в регулоны – совокупности координированно экспрессирующихся генов, контролирующих одну определенную функцию (этапы расщепления или синтеза какого-либо вещества). Гены в регулоне пространственно отдалены друг от друга. Каждый ген имеет собственные промотор, оператор и терминатор транскрипции. В некоторых регулонах часть генов объединена в опероны (например аргининовый регулон состоит из шести отдельных генов и двух оперонов).

Некоторые опероны (и регулоны), контролирующие синтез аминокислот, содержат ещё один тип регуляторных элементов – аттенюаторы. Аттенюатор – это нуклеотидная последовательность с инвертированными повторами, расположенная между промотором и первым геном оперона. Вторичная структура аттенюатора изменяется в зависимости от наличия или отсутствия в клетке аминокислоты, синтез которой контролируется данным опероном (или регулоном). В аттенюаторе закодирован пептид, содержащий несколько, расположенных друг за другом, аминокислотных остатков данной аминокислоты. Когда концентрация аминокислоты в клетке в результате её синтеза (или поступления извне) достаточно высокая, происходит синтез аттенюаторного пептида. В результате изменяется вторичная структура ДНК в аттенюаторе таким образом, что транскрипция оперона прекращается. (Аттенюатор, таким образом, приобретает характер терминатора). При низкой концентрации аминокислоты в клетке пептид не синтезируется и структура аттенюатора не мешает транскрипции.

 

 

31-32.

Сенсорные системы

 

Для бактерий (как, впрочем, и для любого другого организма) способность координировать экспрессию генов с изменениями условий окружающей среды дает существенное селективное преимущество. Адаптация бактерий к изменяющимся условиям среды контролируется белковыми системами передачи сигнала. Такие системы состоят из белковых модулей-доменов, собранных в несколько молекул, количество которых варьирует в зависимости от вида бактерии и конкретного фактора среды. Основными компонентами сенсорных систем являются:

· сенсоры (трансмембранные или цитоплазматические), детектирующие изменения окружающих условий;

· внутриклеточные посредники, получающие информацию от сенсоров и передающие ее на эффекторы;

· эффекторы - непосредственные регуляторы физиологического ответа (как правило, на уровне транскрипции).

Трансмембранные рецепторы.

Механизм детекции сигнала не совсем ясен. Детектируемый сигнал может быть как вне-, так и внутриклеточным. В некоторых случаях показано, что сигнал детектируется периплазматическим доменом. Так, PhoQ - регулятор экспрессии факторов вирулентности у Salmonella typhimurium, - является сенсором дивалентных катионов, которые, связываясь непосредственно с периплазматическим доменом, стабилизируют неактивную конформацию PhoQ. Сигнал может быть внутриклеточным. Рецептор Aer, участвующий в регуляции аэротаксиса, детектирует внутриклеточный запас энергии, связываясь с FAD. Еще один пример – детекция внутриклеточной концентрации глутамина при регуляции азотного метаболизма. В ряде случаев показано, что сенсором является трансмембранный домен. Так, Cpx-путь активирован у мутантов E. coli, лишенных фосфатидилэтаноламина - таким образом, простое нарушение мембранной структуры приводит к активации этого сигнального пути. У белка EnvZ E. coli - гистидинкиназы, участвующей в осморегуляции, периплазматический домен может быть делетирован без потери сенсорной функции.

Механизм передачи сигнала.

Многие бактериальные рецепторы имеют периплазматический домен-детектор (P) и

цитоплазматический сигнальный домен (C), заякоренные в мембране двумя α-спиральными трансмембранными сегментами. Линейная структура таких белков может быть представлена как TM1–P–TM2–L–C, где L - цитоплазматический линкер. Сигнальный домен либо сам является гистидинкиназой (EnvZ) либо с гистидинкиназой

взаимодействует (MCP рецепторы хемотаксиса).

Механизм передачи сигнала с сенсорного на сигнальный домен неясен. Рецепторы обычно являются мембранными белками, гомодимерами. Предполагалось, что конформационные изменения, возникающие при связывании субстрата, передаются через мембрану на цитоплазматические домены рецептора, что влияет на взаимодействие сигнальных доменов между собой. Однако делеция одного из двух сигнальных доменов (равно как и удаление всех трансмембранных сегментов) у димера не лишает его активности.

Двухкомпонентная система состоит из двух белков –гистидиновой протеинкиназы

(ГК), содержащей консервативный киназный домен и регулятора ответа (РО), содержащего консервативный регуляторный домен.

Внеклеточные сигналы детектируются ГК, что приводит к изменению ее активности.

Затем ГК передает фосфогруппу на РО (реакцию катализирует сам РО). Перенос фосфата на РО приводит к активации эффекторного домена этого белка, что и вызывает в конечном итоге специфический физиологический ответ.

 

 

Регуляторный домен.

Наиболее консервативная часть белка, содержит кластер остатков аспартата, которые связывают Mg2+ и формируют активный сайт для переноса фосфата

Эффекторный домен

Эффекторным доменам сложно дать общую характеристику по причине их большогоразнообразия. Большинство эффекторных доменов имеет ДНК-связывающую активность и действиет путем активации или репрессии транскрипции специфических генов. Тем не менее, узнаваемые

последовательности ДНК, расположение сайтов связывания и механизм транскрипционной регуляции существенно различаются, даже у РО из одного подсемейства.

Сенсоры:

Линкерный домен

У трансмембранных ГК периплазматический сенсорный домен соединяется с цитоплазматическим киназным ядром при помощи трансмембранной α-спирали и цитоплазматического линкера. Линкерные домены совершенно необходимы для нормального функционирования сенсорных ГК, однако об их функциях известно немного. Размер линкеров варьирует в пределах 40-180 АК. Многие из них имеют характерный α-спиральный coiled coil мотив, в большинстве случаев предшествующий фосфорилируемому гистидиновому остатку киназного ядра. Две наиболее вероятные функции линкерных доменов – правильное расположение мономеров в димере ГК и передача сигнала от сенсорной к киназной части белка.

Каталитическое киназное ядро.

Унифицирующим структурным свойством семейства ГК является характерное киназное ядро, состоящее из домена димеризации и АТФ/АДФ-связывающего фосфотрансферного или каталитического домена.

Киназное ядро имеет размер ~350 АК и отвечает за связывание АТФ и осуществление киназной реакции. Консервативный остаток гистидина, являющийся субстратом киназной реакции, располагается в домене димеризации.

HPt-домены у прокариот встречаются исключительно в составе гибридных киназ, тогда как у эукариот – как отдельные белки. Эти домены имеют размер около 120 АК и содержат остаток гистидина, способный

участвовать в фосфотрансферных реакциях. HPt-домены не имеют ни киназной, ни фосфатазной активности, поэтому они идеально приспособлены для коммуникации между различными белками. При всем разнообразии первичных последовательностей HPt-доменов их третичная структура очень схожа и напоминает таковую домена димеризации киназного ядра, включая

расположение консервативного гистидинового остатка.

Сенсорный домен

Изменения в окружающей среде детектируются непесредственно (или опосредованно) аминоконцевым сенсорным доменом ГК. Между разнообразными мембранными сенсорными доменами практически полностью отсутствует сходство на уровне первичной последовательности, что поддерживает идею о специфичности детектируемых ими взаимодействий. В большинстве случаев специфический стимул и механизм его детекции остаются неизвестными. Информация о трехмерной структуре этих доменов начинает появляться только сейчас, поэтому как сигнал передается к киназному ядру, пока не ясно.

51. Архитектура регуляторных систем
Элегантность двухкомпонентных систем заключается в их модулярности. Простейшая сигнальная система может состоять из одной пары ГК(гистидиновая протеинкиназа)-РО(регулятор ответа). В более сложных случаях домены, входящие в состав ГК и РО, а также HPt-домены могут комбинироваться, образуя уже сигнальную цепочку или даже сеть, известную под названием фосфотрансляционная система (система передачи фосфата). Классические двухкомпонентные системы доминируют у прокариот, тогда как фосфотрансляционные системы чаще встречаются у эукариот (хотя прокариотические примеры тоже имеются). Дополнительная сложность фосфотрансляционных систем позволяет ввести дополнительные стадии контроля а также возможность взаимодействия между различными сигнальными путями. Большинство регуляторных систем устроены просто. Трансмембранная сенсорная ГК посредством одной реакции передачи фосфата активирует цитоплазматический РО, который вызывает

соответствующий адаптивный ответ. Фосфотрансляционные системы

Еще более усложненные версии двухкомпонентных систем используют более одного акта передачи фосфата. Такие сигнальные пути называют фосфотрансляционными системами (системами передачи фосфата). В простейшем случае фосфотрансляционная система удлиняет цепочку передачи фосфата на два шага, Asp -> His и His -> Asp. Таким образом, базовая фосфотрансляционная система имеет уже четыре фосфорилированных белковых продукта и пять реакций переноса фосфата.

Множественные фосфорилируемые домены фосфотрансляционных систем создают возможность альтернативных путей передачи фосфата. В гибридной ГК ArcB любой из имеющихся His-содержащих доменов (димеризационный или же HPt) может получить фосфат от АТФ и передать его РО ArcA. Два

различных варианта используются в аэробных и анаэробных условиях.

Еще более сложная организация может достигаться за счет интеграции различных сигнальных цепочек в сигнальные сети. У B. subtilis практически каждая двухкомпонентная система взаимодействует с как минимум еще одной цепочкой передачи фосфата. В качестве примера такой

интеграции можно привести взаимодействие путей, контролирующих утилизацию фосфата аэробного и анаэробного дыхания и споруляцию. Дыхание и утилизация фосфата регулируются совместно – фосфо-PhoP активирует экспрессию ResD и наоборот. Однако, когда клетка вступает на путь споруляции, и дыхание, и утилизация фосфата репрессируются,

поскольку фосфо-Spo0A негативно регулирует фосфорилированные ResD и PhoP.

 

Хемотаксис у бактерий

Хемотаксис - способность бактерий двигаться по направлению к аттрактантам (зачастую питательным веществам) и от репеллентов (например,токсинов). В качестве аттрактантов выступают практически все сахара и аминокислоты, в качестве репеллентов - жирные кислоты, спирты и другие потенциально вредоносные вещества. Чувствительность бактерий впечатляет - они легко детектируют изменение концентрации на 0.1% при микромолярных концентрациях веществ, а диапазон детектируемых концентраций перекрывает пять порядков. Аттрактанты и репелленты детектируются за счет непосредственного взаимодействия со специфическими хеморецепторами, а не за счет каких-либо внутриклеточных эффектов детектируемого вещества. Мембранные рецепторы группируются в кластеры, как правило расположенные на полюсах клетки, однако это не может помочь бактерии уловить разницу концентраций между полюсами, поскольку она будет слишком маленькой из-за малого размера самой клетки. Вместо этого бактерии ориентируются в химических градиентах путем измерения временных изменений концентраций при движении. Обычно скорость движения эшерихии составляет 10-20 своих длин в секунду. Сравнивая текущую загруженность хеморецепторов специфическими лигандами с таковой несколько секунд назад, клетка фактически может "измерить" разницу концентраций определенного вещества на расстоянии, во много раз превышающем длину самой клетки. Такое измерение концентрации лиганда во времени возможно за счет адаптивного метилирования хеморецепторов, которое зависит от загруженности их лигандами. Задержка во времени между связыванием лиганда и метилированием рецептора представляет собой своеобразную молекулярную

"память", которая и позволяет измерять изменение концентраций лиганда. Если выбранное направление движения соответствует увеличению концентрации аттрактанта (снижению концентрации репеллента), время до следующего кувыркания увеличивается. К сожалению, из-за своего малого размера клетка постоянно сбивается с "верного" пути броуновским движением и поэтому просто не может продолжительно двигаться прямо. Такой механизм поэтому только в общем обеспечивает движение бактерии по градиенту концентрации в нужном направлении, но для бактерий является достаточно эффективным. Механизм, основанный на переключении направления вращения жгутиков, приводящий к прямолинейному движению, которое через варьирующие промежутки времени сменяется кувырканием

на месте, не является единственным. У Rhodobacter sphaeroides вращение единственного жгутика сменяется его полной остановкой, а у Rhizobium meliloti вращение жгутика никогда не прекращается – изменяется только его скорость. Но во всех этих случаях результат работы сенсорной системы хемотаксиса один и тот же – если бактерия движется в "нужном" направлении, продолжительность такого движения увеличивается.

Сенсорный механизм хемотаксиса более сложен, чем рассмотренные нами ранее. Это объясняется прежде всего двумя причинами. Во-первых, поскольку броуновское движение может очень быстро изменить ориентацию бактериальной клетки, клетки должны обрабатывать хемотаксические сигналы очень быстро, и, действительно, от стимула до переключения "моторов" у клетки проходит не более 0.2 секунды. Во-вторых, для правильного сравнения пространственных градиентов клеткам необходимо такое устройство сенсорного механизма, которое "гасило" бы сенсорную стимуляцию в статических условиях, т.е. в отсутствии градиента концентрации, как бы много какого-то аттрактанта или репеллента ни присутствовало бы в среде.

 

4. Устройство и принцип действия двигательного аппарата бактерий Движение бактерий рассмотрим на примере E. coli.Эта бактерия передвигается за счет вращения своих жгутиков, которые действуют как винты корабля.Каждая бактерия может иметь 6 или более "винтов", разбросанных по поверхности клетки случайным образом. Хотя каждый "винт" вращается независимо, но при вращении против часовой стрелки нити жгутиков сближаются за счет гидродинамических сил и образуют пучок, вращающийся в одну сторону позади клетки. Вращение против часовой стрелки приводит к более-менее прямолинейному поступательному движению бактерии, тогда как вращение по часовой стрелке заставляет бактерию кувыркаться на месте. В результате при последующем переключении направления вращения жгутика бактерия начнет двигаться в случайном направлении. В однородной среде бактерия кувыркается примерно раз в секунду.Нить жгутика является тонкой ровной трубкой, созданной из уложенных спирально молекул одного единственного белка – флагеллина. Длина жгутикового филамента варьирует и может достигать10 длин тела бактерии. Нить жгутика прикрепляется к базальному телу при помощи полого гибкого крюка. Крюк прикреплен к оси – полой прямой трубке, составляющей основу ротора жгутика. Ось окружена тремя кольцами – двойным MS кольцом, находящимся в цитоплазматической мембране ислегка выступающим из нее, P кольцом в слое пептидогликана и L кольцом в наружной мембране.Специфическая для компонентов жгутика система секреции III типа, располагающаяся в базальном теле, транспортирует через мембрану белки оси,крюка и нити в правильной последовательности и внужных количествах. Секретируемые компоненты поступают к месту сборки формирующегося жгутика через полость в его центре.Вращение жгутика обеспечивается молекулярным мотором, способным переключатьнаправление вращения.Источником энергии для работы мотора служит трансмембранный протонный градиент. Моторно-переключательный комплекс крепится на цитоплазматической стороне MS кольца и образуетколоколообразную структуру, известную как C-кольцо. Этот комплекс содержит три белка (FliG,FliM и FliN), участвующие в генерации вращательного монента и переключении направления вращения. Считается, что этот комплекс вращается вместе с MS кольцом, осью,крюком и нитью. Статор мотора сделан из двух белков, окружающих MS кольцо. Карбоксиконцевой домен одного из этих белков, MotB, закреплен в клеточной стенке, а четыре гидрофобных спирали MotA взаимодействуют с аминоконцевой мембранной α-спиралью, образуя проводящий протоны канал через цитоплазматическую мембрану.

 

55. Регуляция синтеза жгутикового аппарата

Более 40 генов, кодирующих белки,необходимые для биосинтеза жгутиков,организованы в несколько оперонов. Естественно,что экспрессия такого количества генов находится под строгим контролем. Контроль в данном случае организован иеархически. На вершине иерархии находится flhDC оперон, кодирующий два белка, из которых собирается гетеротетрамерный активации транскрипции генов второго "уровня". Многие глобальные регуляторы, такие, например, как БАК, DnaA, связанный с нуклеоидом белок H-NS,влияют на уровень экспрессии оперона flhDC и на образование жгутиков.Транскрипция генов первых двух уровней обеспечивается РНК-полимеразой с основным сигма-фактором (RpoD). Продуктами генов второго уровня являются белки,входящие в составбазального тела жгутика и крюка, а также регуляторные белки FlgM и FliA. FliA кодирует альтернативный сигма-фактор σ28 или σ F,необходимый для экспрессии генов третьего, и последнего уровня, а FlgM является анти-сигма фактором, ингибирующим активность FliA. Когда секреторный аппарат (базальное тело жгутика) и крюк собираются, FlgM экспортируется из клетки и освобождает FliA, который наконец может активировать поздние гены жгутика.

 

56. Белковый аппарат хемотаксиса. Рецепторы хемотаксиса.

Три класса белков участвуют в хемотаксисе: трансмембранные рецепторы, цитоплазматические сигнальные белки и ферменты адаптивного метилирования.
Рецепторы хемотаксиса. Многие бактерии детектируют хемотаксические стимулы при помощи рецепторов, известных как метилируемые белки хемотаксиса. Эти белки являются мембранными сенсорами, в принципе аналогичными по своей структуре EnvZ, с тем только отличием,что цитоплазматический сигнальный домен не является автокиназой. Функцию автокиназы выполняет другой белок - CheA, а сигнальные домены MCP(моноцитарный хемотаксический протеин) обеспечивают взаимодействие с CheA. Еще одно отличие от типичного сенсора - по обе стороны сигнального домена располагаются сайты метилирования, необходимые для адаптации рецепторов. MCP белки состоят из ок. 550 ак, и явл. димерами. Хорошо изучены 4 MCP из E. coli, реагирующие на серин (Tsr), аспартат и мальтозу (Tar),рибозу, глюкозу и галактозу (Trg) и дипептиды (Tap). У сальмонелл нет Tap, но есть сенсор цитрата Tcp. Серин, аспартат и цитрат связываются непосредственно с рецепторами, тогда как сахара и дипептиды сначала связываются с соответствующими периплазматическими белками, а уже эти комплексы взаимодействуют с рецепторами. Кроме того, MCP реагируют наизменения температуры и pH, а также являются рецепторами для различных репеллентов.
Классический рецептор состоит из

• аминоконцевой трансмембранной спирали,

• периплазматического собственно сенсорного домена, сложенного из четырех α−спиральных участков,

• второй трансмембранной спирали

• большого цитоплазматического сигнального

и адаптационного домена.

Цитоплазматические домены сенсоров содержат 4 или 5 остатков глутамата, доступных для метилирования.

 

57. Цитоплазматические сигнальные белки и регуляторный механизм хемотаксиса
Взаимодействие между рецепторами и переключателем жгутика осуществляется 4 белками:
♦ CheA – ГК(гистидиновая протеинкиназа)

♦ CheY – РО(регулятор ответа)

♦ CheW - "адаптор" между рецептором и CheA

♦ CheZ - белок, способствующий дефосфорилированию CheY~Ф
Пара белков CheA-CheY представляет собой двухкомпонентную регуляторную систему. CheY не является транскрипционным фактором и у него отсутствует ДНК- связывающий домен. ГК CheA функционирует в виде димера, с которым связываются два мономера CheW, и уже этот комплекс вступает в ассоциацию с димерным рецептором. В составе такого комплекса автокиназная активность резко возрастает, что усиливает перенос фосфата от CheА~Ф к CheY. CheY~Ф связывается с FliM моторно-переключательного комплекса базального тела, что приводит к вращению жгутика по часовой стрелке. CheZ предотвращает накопление CheY~Ф, стимулируя автофосфатазную активность CheY. При отсутствии аттрактанта концентрация CheY~Ф поддерживается на уровне, способствующем вращению жгутика преимущественно по часовой стрелке и отсутствию упорядоченного движения бактерии. Связывание аттрактанта с рецептором индуцирует конформационное изменение, которое передается через мембрану и подавляет автокиназную активность CheA. Концентрация CheY~Ф падает, и жгутики бактерии более продолжительное время вращаются против часовой стрелки. Поэтому клетки будут дольше двигаться прямолинейно, если они попадают в среду с более высокой концентрацией аттрактанта. Однако этот механизм не объясняет, как клетка может реагировать на постоянно возрастающую концентрацию аттрактанта.

 

 

58. Компоненты сигнальных путей (рецепторы, G-белки, адаптеры, эффекторы, вторичные мессенджеры).
Рецептор воспринимает экстраклеточный сигнал и запускает каскадный сигнальный механизм внутри клетки. Клетки обладают разными типами специализированных рецепторов, распознающих определенный вид сигнала.
G-белки — особые сигнальные молекулы, обладающие GTPазной активностью,были обнаружены и исследованы А.Гилманом и М. Родбеллом, которые получили за это открытие Нобелевскую премию по физиологии и медицине.G-белки делятся на две основных группы — гетеротримерные («большие») и «малые». Гетеротримерные G-белки — это белки с четвертичной структурой, состоящие из трёх субъединиц: альфа(α), бета (β) и гамма (γ). Малые G-белки — это белки из одной полипептидной цепи. Обе группы G-белков участвуют во внутриклеточной сигнализации.
Гетеротримерные G-белки. У всех гетеротримерных G-белков сходный механизм активации: они активируются при взаимодействии со специфическими рецепторами, сопряженными с G-белками, при этом обменивая ГДФ на ГТФ и распадаясь на α- и βγ-субъединицы.
Взаимодействие рецептора и лиганда приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адаптерами. Адаптер, связавшись с рецептором, вступает во взаимодействие с эффекторами.Адаптерные белки организуют белок-белковые взаимодействия через входящие в их состав SH2 и SH3 домены, передавая сигнал от рецепторов факторов роста к последующим эффекторам.
Эффектор формирует конечные сигналы управления и посылает их к объекту управления системы.
Вторичные мессенджеры — это низкомолекулярные органические соединения или ионы, способные обеспечивать дальнейшую передачу сигнала путем аллостерической регуляции. Активация последующих компонентов сигнальной цепи вторичными мессенджерами осуществляется при достижении ими определенной концентрации. На уровне эффекторов обеспечивается усиление сигнала, так как они синтезируют большое количество вторичных посредников, которые могут активировать множество последующих сигнальных посредников или конечных мишеней.

 

59. Киназы как компоненты сигнальных путей, типы протеинкиназ.
Сигнальные пути MAPK (митоген-активируемая протеинкиназа) — группа мультифункциональных внутриклеточных сигнальных путей, содержащих одну из митоген-активируемых протеинкиназ и контролирующих транскрипцию генов, метаболизм, пролиферацию и подвижность клеток и другие процессы. Сигнальные пути MAPK консервативны у эукариот и содержат характерный модуль, состоящий из трёх протеинкиназ. Эти пути активируются внеклеточными сигналами, такими как гормоны, факторы роста, хемокины и нейротрансмиттеры, которые распознаются соответствующими рецепторными тирозинкиназами или рецепторами, ассоциированными с G-белками. Рецепторы активируют ГТФазы семейств Ras и Rho. ГТФазы передают сигнал на модуль, состоящий из киназы киназы митоген-активируемой киназы, которая фосфорилирует и активирует киназу митоген-активируемой киназы, которая, в свою очередь, активирует митоген-активируемую киназу. MAPK фосфорилируют белки-мишени по остаткам серина и треонина и таким образом передают сигнал дальше. Кроме киназ, в состав сигнальных путей входят протеинфосфатазы и белки, которые обеспечивают сборку белковых комплексов.
Существует три типа протеинкиназ: Тирозинкиназы, серин/треонин протеинкиназы, которые обычно локализуются в цитоплазме, и протеинкиназы, которые могут фосфорилировать белки как по тирозину, так и по серину с треонином. Помимо рецепторных тирозин киназ существуют и тирозинкиназы, которые располагаются в цитоплазме клетки.
Тирозиновые протеинкиназы — ферменты, которые переносят фосфатную группу от АТФ наостаток аминокислоты тирозина в белке. Большинство тирозиновых киназ имеют сопряженные тирозинфосфатазы. Тирозиновые киназы классифицируют на две группы: цитоплазматические и трансмембранные (связанные с рецептором). Структура: АТФ-связывающий сайт, три АК-остатка,ассоциируемых со связыванием третьей фосфатной группы молекулы АТФ, связанной с энзимом, и возможный каталитический сайт, являющийся аминокислотой. Серин-треониновые протеинкиназы фосфоририруют гидроксильную группу в остатках серина или треонина. Активность этих протеинкиназ регулируется несколькими событиями (например, повреждениями ДНК), а также некоторыми химическими сигналами, в том числе, cAMP, cGMP, диацилглицеролом, Ca2+кальмодулином.

 

 

60. Способы передачи сигнала через клеточную мембрану
Важнейшим этапом, контролирующим функцию клеток, является момент превращения внеклеточных сигналов во внутриклеточные. Существует две группы механизмов, обеспечивающих трансмембранную передачу сигнала. Они различаются по способности связываться с рецепторами наружной мембраны клетки: ряд сигнальных молекул связывается с ними, другие – нет. Передача сигнала, не требующая наличия рецепторов на поверхности клетки. Относительно небольшое количество сигнальных молекул представлено веществами с низкой молекулярной массой или высокой степенью гидрофобности. В результате они достаточно легко преодолевают плазматическую мембрану за счет диффузии. Их классификация основана на особенностях взаимодействия с внутриклеточными компонентами. Выделяют две основные группы сигнальных молекул:

1. Сигнальные молекулы, взаимодействующие с внутриклеточными рецепторами. Наиболее известными представителями являются стероидные (кортизол, эстрадиол, тестостерон) и тиреоидные (тироксин) гормоны.

Пройдя через плазматическую мембрану, они связываются с белками, находящимися в цитозоле или ядре. Указанные рецепторные молекулы представляют собой генные регуляторные белки (gene regulatory proteins),изначально находящиеся в клетке в неактивном состоянии. Под действием гормонов они претерпевают большие конформац