Занятие № 11. Хроматографический метод в анализе лекарственных средств.

Хроматография – метод разделения и анализа смесей веществ, а также изучения физико-химических свойств веществ. Основан на распределении соединений между двумя фазами – неподвижной и подвижной (элюент). Хроматографические методы применяют для разделения, очистки, идентификации и количественного определения исследуемых соединений. Качественной характеристикой во всех видах хроматографии является подвижность определяемого вещества, которая зависит от его структуры и молекулярной массы, а также от условий хроматографирования. Отношение пути перемещения вещества к пути перемещения растворителя есть величина постоянная, обозначаемая R_f. Она является константой для данных условий разделения и используется для идентификации лекарственных веществ. Количественной характеристикой служит интенсивность аналитического сигнала, который в различных методах различен: например, размеры и интенсивность окраски пятна на пластинке, величина отклика детектора и др.

 

Основы хроматографии.

Классификация видов хроматографии может быть различной в зависимости от признака, положенного в основу.

I. По агрегатному состоянию фаз или по характеру подвижной и неподвижной фазы

1. Газо-жидкостная хроматография

2. Газо-твёрдофазная или газо-адсорбционная хроматография

3. Жидкостно-жидкостная хроматография

4. Жидкостно-твёрдофазная хроматография

II. По механизму разделения компонентов на молекулярном уровне. Например,

1. Распределительная хроматография. В распределительной хроматографии разделение происходит за счет разной растворимости веществ в подвижной фазе (растворителе) и неподвижной фазе, находящейся на поверхности неподвижного носителя.

2. Ионообменная хроматография. Этот вариант хроматографии позволяет разделять ионы и полярные молекулы, основываясь на ионных взаимодействиях. Неподвижная фаза имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми ионизированными молекулами противоположного заряда. Этот вариант хроматографии подразделяют на два типа – катионную и анионную хроматографию: катионная ионообменная хроматография задерживает положительно заряженные катионы, так как неподвижная фаза имеет отрицательно заряженные функциональные группы, например, фосфат (PO₄^3-); анионная хроматография задерживает отрицательно заряженные анионы, так как неподвижная фаза имеет положительно заряженные функциональные группы.

3. Адсорбционная хроматография. Этот вид хроматографии основан на адсорбции исследуемых веществ поверхностью твердой неподвижной фазы.

III. По технике выполнения

1. Колоночная хроматография. Компоненты разделяют на колонке – трубке, заполненной хроматографическим сорбентом.

2. Капиллярная хроматография. Разновидность колоночной хроматографии; для разделения используют трубку (капилляр), в которой слой сорбента расположен только на внутренних стенках колонки, а центральная часть остается свободной.

3. Плоскостная хроматография. Для разделения используют плоский слой сорбента небольшой толщины. Плоскостная хроматография делится на бумажную хроматографию и хроматографию в тонком слое сорбента. Для бумажной хроматографии в качестве неподвижной фазы используют специальную хроматографическую бумагу. В методе хроматографии в тонком слое сорбента неподвижная фаза представляет собой тонкий слой сорбента (например, силикагель), закрепленный на инертной подложке (алюминий, стекло и т.д.)

IV. По цели проведения

1. Аналитическая хроматография. Целью этого метода является собственно хроматографическое определение.

2. Препаративная хроматография проводится с целью выделения индивидуальных соединений из смеси в чистом виде. В отличие от аналитической хроматографии, препаративные разделения проводят на колонках большого диаметра и используют специальные устройства для сбора отдельных компонентов (фракций). В лабораториях используют колонки диаметром 8-15 мм и выделяют обычно от 100 мг до 10 г индивидуального вещества; в промышленности созданы колонны диаметром до 50 см, на которых возможно проводить разделение нескольких тонн вещества. Эффективность препаративных колонок меньше по сравнению с используемыми в аналитической хроматографии.

Хроматография на бумаге. Носителем неподвижной фазы (например, воды) служит специальная хроматографическая бумага. Распределение происходит между водой, находящейся на поверхности бумаги, и подвижной фазой, которая представляет собой систему из нескольких растворителей. Испытание выполняют согласно требованиям ГФ или ФС (ФСП). Для подтверждения подлинности одновременно хроматографируют испытуемое вещество и стандартный образец. Если они идентичны, то пятна на хроматограммах будут иметь одинаковый вид и равные значения R_f.

, где

А – расстояние от линии старта до центра пятна, мм;

В – расстояние от линии старта до линии финиша, мм.

Чтобы исключить влияние на ошибку определения условий хроматографирования, пользуются более объективной константой Rs, которая представляет собой отношение величин R_f испытуемого и стандартного образцов. Хроматографию используют при испытании на чистоту. О наличии примесей судят по появлению дополнительных пятен на хроматограмме. Анализируемое вещество и примесь обычно имеют разные значения R_f.

Количественное содержание вещества можно определить непосредственно на хроматограмме, используя планиметрический, денситометрический, люминесцентный и другие методы. Используют также способы, основанные на элюировании анализируемого вещества из вырезанного и измельченного участка хроматограммы с соответствующим пятном. В элюате содержание испытуемого вещества определяют фотометрическим или электрохимическим методом.

Хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ) отличается от хроматографии на бумаге тем, что процесс хроматографирования происходит на носителе (сорбенте), нанесенном тонким слоем на инертную поверхность. Твердый сорбент может быть закрепленным или незакрепленным на этой поверхности. Сорбентом служит силикагель, оксид алюминия и др. Для закрепления добавляют небольшие количества крахмала или сульфата кальция. Используют также пластинки промышленного изготовления типа «Сорбфил УФ-254», «Сорбфил» и др.

Преимуществами ТСХ является простота приемов и оборудования, более высокая чувствительность, чем у бумажной хроматографии, устойчивость пластинок к температурным и химическим воздействиям, значительно большие возможности процессов разделения, детектирования, элюирования, меньшая продолжительность выполнения испытания. Все это создает широкие возможности в использовании ТСХ для выполнения испытаний на подлинность, на чистоту, для количественного определения лекарственных веществ в лекарственных формах.

Двумерное хроматографирование отличается повторным (после высушивания) пропусканием той же или иной подвижной фазы, но в перпендикулярном по отношению к первоначальному направлению. При этом используют квадратные пластины или листы бумаги.

В фармацевтическом анализе широко применяют сочетание ТСХ с физико-химическими методами анали­за. Тайне комбинированные методы, как хромато-спектрофотометрия, хромато-флуориметрия, хромато-масс-спектроскопия, особенно эффективны в анализе ЛРС и препаратов, содержащих большое число сопутствующих компонентов.

Газожидкостная хроматография (ГЖХ) основана на распределении компонентов смеси между газовой и жидкой или твердой фазами. Распределение происходит в результате многократных актов сорбции и десорбции анализируемых веществ, которые вводятся в поток газа-носителя, испаряются и в парообразном состоянии проходят через колонку с сорбентом. Поэтому метод ГЖХ применим для анализа летучих веществ или веществ, которые могут бить переведены в газообразное состояние. Разделенные вещества элюируются из колонки потоком газа-носителя, регистрируются детектором и фиксируются на хроматограмме в виде пиков, по которым можно идентифицировать или определять содержание каждого компонента смеси.

Газовый хроматограф включает в себя систему измерения и регулирования скорости потока газа-носителя, систему ввода пробы испытуемого образца, газохроматографическую колонку, систему термостатирования и контроля температуры в различных узлах прибора и систему детектирования, регистрации и обработки информации, полученной на приборе.

Подлинность лекарственных веществ методом ГЖХ можно подтвердить либо с помощью свидетелей, либо методом относительных удерживаний. В первом случае доказательством идентичности служит совпадение времени удерживания вещества-свидетеля и одного из компонентов смеси лекарственного вещества при хроматографировании каждого в отдельности в одинаковых условиях. Во втором случае вещество-свидетель добавляют к пробе, затем анализируют по рекомендуемой методике. Рассчитывают по формуле величину относительного удерживания, которая является постоянной для лекарственного вещества в конкретных условиях. Количественный анализ выполняют в тех же условиях, используя для расчетов такие параметры, как площадь или высота пиков лекарственных веществ. Площадь пиков устанавливают на хроматограмме с помощью планиметра, интегратора или умножением высоты пика на его полуширину.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)отличается от ГЖХ тем, что подвижной фазой служит не газ, а жидкость, причем она проходит через колонку, наполненную сорбентом, с большой скоростью за счет значительного давления, Поэтому ВЭЖХ позволяет разделять многокомпонентные смеси на индивидуальные вещества высокой степени чистоты. ВЭЖХотличается высокой чувствительностью. На разделение 10-15 компонентов затрачивается 20-30 мин.

Жидкостный хроматограф включает такие узлы, как дозатор, насос высокого давления, высокоэффективная колонка, детектор с регистрирующим устройством. Колонки изготавливают из нержавеющей стали, они имеют длину 10-25 см. Внутренний диаметр 0,3 – 0,8 см и плотно набиваются адсорбентом с размером частиц 5 – 10 мкм. В качестве элюента используют различные углеводороды в сочетании с этанолом. Детектором обычно служит спектрофотометр с переменной длиной волны (190-900 нм), но существуют также флуориметрические, электрохимические и другие детекторы.

Идентификацию испытуемых лекарственных веществ проводят по времени выхода каждого компонента смеси из колонки, которое будет стабильно при одинаковых условиях проведения эксперимента. Количественное содержание рассчитывается по площади пика, которая пропорциональна количеству лекарственного вещества в пробе.