Занятие № 12. Фотометрические методы в анализе лекарственных средств.

Оптическая спектроскопия основана на регистрации поглощения или излучения исследуемым образцом электромагнитных волн. В зависимости от используемого диапазона длин волн, спектральные методы делятся на спектрофотометрию в УФ-, видимой и ИК-области.

Механизм поглощения молекулами электромагнитного излучения с различной длиной волны различен. В УФ- и видимой областях спектральные характеристики веществ связаны с переходами валентных электронов с одного электронного уровня на другой; ИК-спектры связаны с колебательными и вращательными движениями молекул и отдельных атомов в молекулах.

При облучении исследуемого вещества электромагнитным излучением с постепенно меняющейся длиной волны можно проследить изменение интенсивности его поглощения. Графическое изображение этой зависимости называется электромагнитным спектром:

Область интенсивного поглощения в нем называется максимумом поглощения. Длина волны, при которой наблюдается максимум поглощения называется аналитической длиной волны и обозначается λ_max.

Интенсивность поглощения зависит от концентрации вещества. Математически эта зависимость выражается законом светопоглощения (закон Бугера-Ламберта-Бера):

, где

 – интенсивность падающего света

 – интенсивность прошедшего через раствор света

 – коэффициент светопоглощения

 – концентрация растворенного вещества

 – толщина поглощающего света

В логарифмической форме уравнение имеет вид:

Величину логарифма отношения интенсивности падающего света к интенсивности прошедшего через раствор света называют оптической плотностью и обозначают буквой D.

Величина коэффициента светопоглощения является физической константой, которая зависит от природы растворенного вещества, растворителя, температуры и длины волны света. В зависимости от способа выражения концентрации вещества, коэффициент называют удельным показателем поглощения или молярным показателем поглощения.

Удельный показатель поглощения – это оптическая плотность раствора с концентрацией 1% и толщиной поглощающего слоя 1 см (). Молярный показатель поглощения – это оптическая плотность раствора с концентрацией вещества 1 моль/л и толщиной поглощающего слоя 1 см (). Удельный и молярный показатели поглощения определяются для каждого вещества экспериментально и зависят от природы соединения.

Спектрофотометрия в УФ- и видимой областях – один из наиболее широко используемых физико-химических методов в фармацевтическом анализе.

Анализируемые лекарственные вещества должны иметь в структуре молекулы хромофорные группы (сопряженные связи, ароматическое ядро и др.), обуславливающие различные электронные переходы в молекулах и поглощение электромагнитного излучения.

Измерение спектров поглощения растворов анализируемых веществ в УФ (190 – 380 нм) и видимой (380 – 780 нм) областях производят с помощью спектрофотометров различных марок. В качестве растворителей используют свободные от примесей воду, растворы кислот и щелочей, этанол, хлороформ и другие органические растворители.

Идентификацию лекарственных веществ можно провести по удельному показателю поглощения, характеру спектральных кривых в различных растворителях, положению максимума и минимума светопоглощения или их отношению при различных длинах волн. Для количественного спектрофотометрического анализа важен выбор аналитической полосы поглощения. Последняя должна быть свободна от наложения полос поглощения других компонентов смеси и иметь достаточно высокий удельный показатель поглощения анализируемого вещества.

Фотоэлектроколориметрия (ФЭК)отличается от спектрофотометрического анализа тем, что анализируемое вещество с помощью какого-либо реагента переводят (количественно) в окрашенное соединение. Вначале получают окрашенные растворы, используя растворы стандартных образцов (ГСО или РСО). Измерение оптической плотности производят на фотоэлектроколориметрах. Затем строят калибровочный график зависимости интенсивности поглощения окрашенных растворов от концентрации, по которому рассчитывают содержание лекарственных веществ в испытуемых образцах лекарственных препаратов или лекарственных формах.

Метод дифференциальной спектрофотометрии и фотоэлектроколориметрии основан на измерении светопоглощения анализируемого раствора относительно раствора сравнения, содержащего определенное количество стандартного образца испытуемого вещества или его заменителя. Такой прием приводит к изменению рабочей области шкалы прибора и снижению относительной погрешности определения до ±0,5 – 1%, т.е. сопоставимой с титриметрическими методами.

Спектрофотометрия в ИК-области. Природа полос поглощения в ИК-области связана с колебательными переходами и изменением колебательных состояний ядер, входящих в молекулу поглощающего вещества Поэтому поглощением в ИК-области обладают молекулы, дипольные моменты которых изменяются при возбуждении колебательных движений ядер. Область применения ИК-спектроскопии аналогична, но более широка, чем у УФ-метода, ИК-спектр однозначно характеризует всю структуру молекулы, включая незначительные ее изменения. Важные преимущества ИК-спектроскопии – высокая специфичность, объективность полученных результатов, возможность анализа веществ в кристаллическом состоянии. Для измерения ИК-спектров на однолучевых или двулучевых ИК-спектрофотометрах используют взвеси веществ в вазелиновом масле или помещают анализируемое вещество между пластинами из бромида калия. Каждый ИК-спектр представляет собой серию полос поглощения, максимумы которых определяются волновым числом, измеряемым в см^-1, и определенной интенсивностью. Для анализа лекарственных веществ обычно используют спектральную область от 4000 до 400 см^-1.

ГФ рекомендует два способа установления подлинности по ИК-спектрам. Один из них основан на сравнении зарегистрированных в идентичных условиях ИК-спектров испытуемого лекарственного вещества и его стандартного образца. Второй способ заключается в сравнении ИК-спектра испытуемого лекарственного вещества с его стандартным спектром, прилагаемым к фармакопейной статье и зарегистрированным в соответствии с указанными в ней требованиями.

 

Задачи с эталонами решений.

1. В препарате «Фосфаден» (ФС 42-1960-99) определяют поглощающие примеси. Измеряют оптическую плотность 0,001% раствора препарата в 0,01 моль/л раствора хлористоводородной кислоты в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм при длинах волн 250, 260 и 280 нм. В качестве раствора сравнения используют 0,01 моль/л раствор хлористоводородной кислоты. Отношение  должно быть от 0,80 до 0,87. Оптические плотности при длинах волн 250 и 260 нм равны 0,430 и 0,506, соответственно.

Отношение  равно 0,231.

Рассчитайте их соотношение и выявите, укладывается ли оно в допустимое количество.

Рассчитайте, какая должна быть оптическая плотность при длине волны 280 нм.

Решение.

Рассчитывают отношение оптических плотностей при 250 и 260 нм:

Из отношения оптических плотностей при 280 и 260 нм рассчитывают :

Ответ. Отношение , что укладывается в нормы ФС;

 

2. Рассчитайте оптическую плотность раствора метилтестостерона при длине волны 240 нм, если  равен 540, концентрация исследуемого раствора 0,001% в 95% этаноле, толщина слоя 10 мм.

Решение.

Оптическую плотность раствора метилтестостерона с помощью удельного показателя полощения рассчитывают по формуле:

Ответ. Оптическая плотность раствора метилтестостерона при 240 нм равна 0,540.

 

3. Рассчитайте количественное содержание левомицетина стеарата в субстанции.

Методика определения. Около 0,04 г (т.н.) левомицетина стеарата растворяют в 95% этаноле в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора этанолом до метки (раствор А). 10 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора этанолом до метки (раствор Б).

Определят оптическую плотность полученного раствора Б на СФ при длине волны 272 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Параллельно измеряют оптическую плотность 0,002% раствора СО левомицетина стеарата при длине волны 275 нм.

Оптические плотность испытуемого и стандартного растворов равны соответственно 0,360 и 0,400. Точная масса препарата – 0,0369 г.

Решение.

Согласно следствию из закона светопоглощения . С учетом приготовления раствора левомицетина стеарата:

Ответ. Содержание левомицетина стеарата в лекарственном препарате составляет 48,78%.

 

Задачи для самостоятельной работы.

1. Определение подлинности и чистоты препаратов.

1.1. В препарате «Кислота фолиевая» (ФС 42-2479-95) определяют поглощающие примеси: 0,001% раствор кислоты фолиевой в 0,1 моль/л растворе натрия гидроксида имеет максимумы поглощения при длинах волн 256, 283 и 365 нм.

Отношение .

Рассчитайте, какая должна быть оптическая плотность при длине волны 256 нм, если при λ=365 нм она равна 0,260.

 

1.2. В препарате «Феноксиметилпенициллин» (ФС 42-2579-97) определяют поглощающие примеси следующим образом: около 0,1 г препарата (точная навеска) растворяют в 4 мл 5% раствора натрия гидрокарбоната, разводят водой в мерной колбе вместимостью 500 мл до метки и определяют оптическую плотность при длинах волн 268 и 274 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 4 мл 5% раствора натрия гидрокарбоната, разведенные водой до 500 мл.

Отношение .                      

Оптическая плотность раствора при длине волны 268 нм равна 0,645. Рассчитайте, какая будет оптическая плотность при длине волны 274 нм.

 

1.3. В препарате «Ретинола ацетат» (ФС 42-3029-94) при оценке чистоты определяют поглощающие примеси. Измеряют оптическую плотность 0,0003% раствора препарата в абсолютном этаноле или хлороформе при длинах волн 300, 311,5, 326, 337 и 360 нм. Отношения значений оптической плотности при 300, 311,5, 337 и 360 нм к оптической плотности при 326 нм не должны отличаться более чем на ±0,03.

 

Длина волны, нм	D	D/D^326
300	0,368	0,573
311,5	0,550	0,875
326	0,640	1,000
337	0,548	0,857
360	0,187	0,292

 

Рассчитайте отношение оптических плотностей ретинола ацетата, сравните их с указанными выше, соответствуют ли они указаниям НД и сделайте заключение, - удовлетворяет ли препарат требованиям ФС на поглощающие примеси.

 

1.4. Определение подлинности препарата «Наркотин» (ФС 42-1304-87) осуществляют следующим образом. УФ-спектр 0,005% раствора препарата в метаноле в области от 230 до 350 нм имеет максимумы поглощения при 292±2 нм, при 310±2 нм и минимум поглощения при 263±2 нм.

Отношение оптической плотности при 310 нм к оптической плотности при 292 нм должно быть не менее 1,2 и не более 1,25.

Постройте примерный график зависимости оптической плотности от длины волны. 

Рассчитайте отношение оптических плотностей, если ,  и сделайте заключение, удовлетворяет ли препарат требованиям ФС.

 

2. Расчет удельного показателя поглощения и оптической плотности

2.1. Рассчитайте  метандростенолона, если оптическая плотность равна 0,520 при длине волны 245 нм, концентрация раствора 0,001% в 95% этаноле, толщина слоя 10 мм.

2.2. В препарате «Дигитоксин» (ФС 42-2415-85) рассчитать .

Методика определения. Около 0,02 г препарата (точная навеска), высушенного при температуре 100-105°С, растворяют в 95% этаноле в мерной колбе вместимостью 50 мл, 5 мл этого раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем 95% этанолом до метки. К 5 мл полученного раствора прибавляют 5 мл раствора натрия пикрата, выдерживают 20 мин при комнатной температуре.

Оптическая плотность полученного раствора при длине волны 495 нм и толщине слоя 10 мм равна 0,880. Точная масса препарата, взятая для анализа, равна 0,0200.

2.3. Рассчитайте оптическую плотность раствора препарата «Феноксиметилпенициллин» (ФС 42-2579-97) при длинная волн 268 и 274 нм.

Методика определения. Около 0,1000 г препарата (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 500 мл, растворяют в 4 мл 5% раствора натрия гидрокарбоната доводят объем водой до метки, перемешивают. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на СФ при длинах волн 268 и 274 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Раствором сравнения служит 4 мл 5% раствора натрия гидрокарбоната, разведенные водой до 500 мл.

Отношение .

 при длине волны 268 нм равен 34,8.

2.4. Для препарата «Фурацилин» (ФС 42-2522-88) постройте график зависимости оптической плотности от концентрации при длине волны 375 нм и рассчитайте , используя данные таблицы.

С∙10^-4% фурацилина	Оптическая плотность
5	0,326
6	0,392
7	0,458
8	0,522
9	0,589
10	0,655

Рассчитайте концентрацию фурацилина, используя калибровочный график и найденное значение .

Методика определения. Около 0,02 г (точная навеска) фурацилина растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. К 0,5 мл полученного раствора прибавляют 9,5 мл воды, перемешивают и измеряют оптическую плотность на СФ в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм относительно воды. Оптическая плотность полученного раствора 0,650. Точная навеска препарата 0,0200 г.

2.5. Рассчитайте  доксициклина гидрохлорида (ФС 42-2545-88) при длине волны 349 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 10 мм, если оптическая плотность равна 0,650, точная масса равна 0,0736 г.

Методика определения. Около 0,07 г (т.н.) ГСО доксициклина гидрохлорида растворяют в мерной колбе вместимостью 200 мл в смеси 1 моль/л раствора хлористоводородной кислоты и метанола (1:99), доводят объем раствора указанной смесью до метки и перемешивают. 5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора той же смесью растворителей до метки и перемешивают. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на СФ. В качестве раствора сравнения используют смесь раствора хлористоводородной кислоты и метанола (1:99).  ГСО доксициклина гидрохлорида должен быть не менее 280 и не более 310.

 

3. Расчет концентрации определяемого вещества в ЛС.

3.1. Рассчитайте количественное содержание гризеофульвина в пересчете на сухое вещество, в процентах.

Методика определения. Около 0,1 г (т.н.) гризеофульвина растворяют в абсолютном этаноле в мерной колбе вместимостью 200 мл, доводят объем раствора этанолом до метки и перемешивают.

2 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора этанолом до метки, перемешивают и определяют оптическую плотность на СФ при длине волны 291 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения – абсолютный этанол.

Оптическая плотность испытуемого раствора равна 0,657,  - 686, потеря в массе при высушивании – 10%, масса препарата – 0,1000 г.

3.2. Рассчитайте концентрацию цианокобаламина в процентах.

Методика определения. Около 0,1 г (т.н.) препарата растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 500 мл, доводят объем раствора водой до метки. 25 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводят объем раствора водой до метки. Определяют оптическую плотность полученного раствора на СФ при длине волны 361 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения – вода.  - 207.

Содержание цианокобаламина пересчитывают на сухое вещество. Содержание влаги в нем 12,0%, оптическая плотность - 0,341, масса препарата – 0,1000 г.