Тема 7 Использование культуры клеток в вирусологии

Цель занятия: ознакомиться с общими сведениями о куль­туре клеток и методами ее получения, сохранения, поддержания; ознакомиться с оборудованием и растворами, используемыми для работы с культурой клеток; овладеть методикой световой микроскопии некоторых видов перевиваемых культур клеток.

Изучение вирусов вплоть до 40-х годов 20-го века проводили исключительно на лабораторных животных. Однако, животные оказались чувствительными к ограниченному числу вирусов и это привело к поиску других моделей живых систем, более универсальных и чувствительных к вирусам. Такой живой системой стала культура клеток.

Культура клеток — это клетки тканей различных органов многоклеточного организ­ма, сохраняющие способность к делению и поддержанию своей жизнедеятельности вне организма (in vitro) в искусственных условиях.

Методика культивирования клеток начала активно развиваться после 40–х годов 20 века. До этого времени проводились эксперименты с культурой ткани – отдельными эксплантами, полученными из органа животного и помещёнными в определённые питательные растворы. Однако, такая культура тканей могла поддерживать свою жизнедеятельность крайне ограниченный отрезок времени и была названа переживающей. В дальнейшем с появлением антибиотиков, предупреждающих контаминацию ткани различной микрофлорой, разработкой методики дезагрегации ткани на отдельные клетки и открытием способности вирусов вызывать специфическую деструкцию клеток (цитопатический эффект) стало возможным получить культуру отдельных клеток ткани. Так возникла новая живая система – культура клеток, которая и до настоящего времени является наиболее универсальной и востребованной в различных областях биологии и медицины.

Это связано с тем, что клетки в такой культуре сохраняют способность к делению и поддержанию своей жизнедеятельности вне организма в течение продолжительного времени (в отличие от переживающей культуры ткани), её называют растущей культурой клеток.

Клетки культивируют в основном двумя основными способами – стационарным и суспензионным. При стационарном культивировании клетки находятся в неподвижном стационарном состоянии, будучи адгезированными к определённой поверхности. При суспензионном культивировании клетки находятся в свободно-взвешенном состоянии в питательной среде  при постоянном перемешивании.

Растущая стационарная (монослойная) культура клеток классифицируется на первичную (первично-трипсинизированную), диплоидную, перевиваемую.

Первичная или первично-трипсинизированная культура клеток – это культура клеток, полученная непосредственно из ткани органа и формирующая in vitro один слой клеток (монослой).

Для ее получения используют ткань молодых здоровых животных, а еще лучше, эмбрионов, которые обрабатывают протеолитическими ферментами. Иными словами, проводят дезагрегацию ткани на отдельные клетки. В последнее время область культивирования клеточных культур значительно расширилась. Наряду с уже известными тканями млекопитающих стали использовать ткани низших позвоночных и беспозвоночных (земноводные), насекомых, рыб, растений.

Основное требование при получении первичной клеточной культуры – это стерильные условия работы.

Методика получения первично-трипсинизированной культуры клеток

1 Ткань органа разрезают на небольшие кусочки размером 3 – 5,0 мм и отмывают специальными растворами солей от балласта (слизь, кровь, разрушенные клетки и др.)

2 Отмытые кусочки ткани переносят в колбу с магнитом и заливают 0,25 % раствором трипсина, предварительно подогретого до 37°С

3 Колбу устанавливают на магнитную мешалку и проводят трипсинизацию кусочков ткани в течение 15 – 20 минут. После чего полученную суспензию клеток собирают и охлаждают при 0 - +4 ° С. Кусочки ткани в колбе повторно заливают 0,25 % раствором подогретого трипсина и процедуру трипсинизации повторяют 4 – 5 раз до полной дезагрегации ткани на отдельные клетки (метод дробной трипсинизации).

4 Все фракции полученных суспензий клеток в растворе трипсина объединяют и проводят центрифугирование при 1000 об/мин. в течение 15 мин.

5 Надосадочную фракцию (раствор трипсина) удаляют, к осадку клеток добавляют питательную среду и ресуспендируют.

6 Количество клеток подсчитывают в камере Горяева. Посадочную концентрацию клеток готовят из расчета 1х10⁶ кл./мл на питательной среде.

7 К полученной суспензии клеток добавляют сыворотку крови крупного рогатого скота (до 10 % от объёма суспензии).

8 Полученную суспензию клеток в среде с сывороткой помещают в культуральные флаконы (матрасы) и культивируют в термостате при средней температуре + 37°С.

Наблюдение за культурой клеток проводят методом световой микроскопии.

В процессе культивирования клеток был изучен их жизненный цикл и показана зависимость между количеством клеток в культуре и временем их жизни (рис. 14).

На графике видно, что жизненный цикл культуры клетоксостоит изчетырёх основных этапов

 

 

кол-во клеток

время жизненного цикла I         II                                             III                                             IV

Рис. 14 Жизненный цикл первичной культуры клеток

 

I – этап адаптации: клетки оседают и адгезируются (прикрепление) к поверхности культурального сосуда; распластываются и подготавливаются в клеточному циклу - митозу; продолжительность этапа в среднем 3-5 часов;

II – этап логарифмического роста: клетки вступают в клеточный цикл; контакт соседних клеток между собой запускает процесс ингибирования (торможение) деления этих клеток, что получило название контактное ингибирование; результатом этапа этапа является формирование монослоя клеток; продолжительность этапа в среднем 3-5 суток;

III – этап стационарный: клетки утрачивают способность вступать в клеточный цикл; в них поддерживается обмен веществ (метаболизм); продолжительность этапа в среднем 7-9 суток;

IV – этап дегенерации и гибели клеток: питательная среда в результате жизнедеятельности клеток насыщается продуктами метаболизма клеток, что приводят к их дегенерации; клетки деадгезируются, свободно «плавают» в питательной среде и постепенно разрушаются (лизис); продолжительность этапа в среднем 3-5 суток.

Продолжительность этапов жизненного цикла может варьировать в зависимости от возраста животного и вида ткани, качества растворов и питательных сред, а также от профессиональных навыков исследователя.

Первичную культуру клеток можно пересевать, т.е. проводить пассаж. Пассаж – это перенос клеток в новую питательную среду с целью ее поддержания in vitro. Таким образом, получив единожды из ткани органа культуру клеток, можно длительно поддерживать её жизненный цикл. Культуру клеток, полученную путем пассажа первичной культуры клеток, принято называть субкультурой или клеточной линией. Субкультивирование насчитывает в среднем от 5 и более пассажей, считая от первого пассажа первичной культуры клеток.

В результате субкультивирования можно получить один или несколько клонов клеток, относительно устойчивых в условиям in vitro, обладающих одинаковой морфологией и сохраняющих свой исходный кариотип. Клоны таких клеток можно получать как спонтанно, так и целенаправленно. Данную культуру клеток принято называть диплоидной.

С 1963 г. было принято международное определение, согласно которому диплоидная культура клеток – это морфологически однородная популяция клеток, стабилизированная in vitro, имеющая ограниченный «отрезок жизни» до 50±20 пассажей, характеризующаяся тремя фазами жизни, сохраняющая в результате пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминаций и не обладающая туморогенной активностью при трансплантации золотистым хомякам.

Диплоидная культура клеток в результате длительной селекции может мутировать (мутационная теория), что приводит к незапланированным изменениям в её генетическом аппарате. Например, в результате воздействия на монослой клеток диспергирующим ферментом, особенно в сочетание с «цетрифужным» методом пассажа. Так была получена так называемая перевиваемая культура клеток - морфологически однородная популяция клеток, происходящая из диплоидной культуры клеток в результате её длительной селекции или полученная целенаправленно из раковых клеток млекопитающих и обладающая неограниченным сроком сохранения жизнедеятельности  in vitro.

В табл. 5 представлены некоторые свойства разных видов растущей культуры клеток

Таблица 5

Некоторые сравнительные свойства однослойных культур клеток

Свойства	Культуры клеток
	первичная	диплоидная	перевиваемая
Происхождение	из органа	из субкультуры (клеточная линия)	из диплоидной
Число жизнен-ных циклов	1	50 ± 20	не ограниченное
Морфология клеток	как в исходной ткани органа	фибробластоподобные	эпителиоподобные
Кариотип	диплоидный		гетероплоидный
Тератогенность (туморогенность)	не обладает	не обладает	может обладать
Наличие контаминантов	возможно	отсутствуют

Культур клеток принято обозначать исходя из вида и возраста животного, а также органа, из которого она была получена.  Например, первичная культура клеток почки теленка (ПТ), перевиваемая культура клеток почки теленка – ПТ-80 (рис. 15); перевиваемая культура клеток коронарных сосудов телёнка – КСТ (рис. 16) и т.д. Если культура клеток была получена исследователем целенаправленно в результате селекции, то сам автор даёт ей название. Например, VERO - перевиваемая культура почки зелёной мартышки (рис. 17); HELA- перевиваемая культура клеток из раковой опухоли шейки матки человека, HEP 2 - перевиваемая культура клеток из карциномы гортани человека; КВ - перевиваемая культура клеток из раковой опухоли слизистой полости рта и т.д.

Растворы и питательные среды для культивирования клеток

В работе с культурами клеток используют различные растворы солей, ферментов, а также питательные среды, сыворотку крови млекопитающих и другие билогически активные компоненты.

Сбалансированный солевой раствор (BSS) содержит основные неорганические соли: Ca+, K+, Mg+, Na+; Cl¯, SO₄¯ ¯, НPO₄¯ ¯, HCO₃¯ ¯ и глюкозу. Примером могут быть такие  BSS, как раствор Хэнкса (1949г.), раствор Эрла (1943г.) и др. Их используют в изготовление питательных сред, для препарирования ткани, при промывках, кратковременной инкубации ткани и т.п.

Ферментативные (диспергирующие) растворы применяют в процессе получения первичной культуры клеток (дезагрегация ткани на отдельные клетки), при проведение пассажа. С этой целью используют 0,25 %-ный раствор трипсина на фосфатном буфере, 0,02 %-ный раствор версена (натриевая соль этилендиамитетрауксусной кислоты).

Питательные среды, используемые в настоящее время для культивирования клеточных культур, являются синтетическими и изготавливаются в соответствии с утвержденными рецептурами. Наиболее универсальными в работе с культурами клеток являются среда Игла, среда 199 и их модификации. В их состав входят незаменимые аминокислоты, витамины, соли (простая среда), а также ещё дополнительно и заменимые аминокислоты, нуклеозиды, липиды, гормоны и другие биологически активные компоненты (сложная среда).  

В культивировании клеток широко используют сыворотку крови крупного рогатого скота, лошади (получают из сердца), а  для некоторых клеточных линий человека - сыворотку крови человека. Сыворотка крови содержит факторы, стимулирующие деление клеток (митогены) и их адгезию,  обладает антитрипсиновой активностью, является источником липидов, гормонов, микроэлементов.

Для предупреждения контаминации  культуры клеток в питательную среду могут добавлять антибактериальные препараты, например, антибиотики.

Клетки культивируют в специальной посуде из плотного материала – стекла (многоразовое использование) или полистирола (одноразовое использование). К ней относят матрасы, многолуночные планшеты, чашки Петри разного диаметра, вращательные бутыли с магнитным стержнем для суспензионного культивирования и др.

Преимущества культуры клеток перед другими живыми системами состоит в том, что ее можно получать из разнообразных клеток, которые является мишенями для самых  разных видов вирусов. Кроме того, культуру клеток просто заражать вирусами и в дальнейшем проводить  их индикацию методом световой микроскопии, непрерывно наблюдая за процессом культивирования (в том числе и латентных, персистирующих вирусов), а при необходимости «вмешиваться» в процесс их культивирования. В культуре клеток можно накапливать и собирать большие «урожаи» вирусов в высоком инфекционным титре при минимальном содержании балластных белков. Культуры клеток можно постоянно поддерживать в лабораторных условиях при меньших  материальных затратах по сравнению с лабораторными животными или куриными эмбрионами.

Материальное обеспечение: ткань печени КРС, питательные среды (Игла, 199), солевые растворы (Эрла, Хенкса), 0,25% р-р трипсина, 0,02% р-р версена, сыворотка крови КРС, газовая горелка, стерилизатор с ножницами и пинцетом анатомическим, чашка Петри, стакан лабораторный, колба с магнитом, магнитная мешалка,  стаканы центрифужные, центрифуга, камера Горяева, дозатор механический, наконечники, матрасы, планшеты для культуры клеток, световой микроскоп, 70 ° этиловый спирт, холодильник, термостат.

Примерный план занятия (2 часа)

1 Проведение тестирования студентов 

2 Объяснение преподавателя по теме занятия.

3 Демонстрация: а) метода получения первичной культуры клеток; б) метода световой микроскопии культуры клеток

4 Самостоятельная работа студентов: а) световая микроскопия перевиваемых линий клеток б) выполнение рисунков перевиваемых линий клеток

4 Подведение итогов занятия

5 Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1 Что такое культура клеток? Какие преимущества у культуры клеток перед другими живыми системами?

2  Как классифицируют культуры клеток?

3 Какую культуру клеток называют первичной? Каким методом её полу-

чают?

4  Из каких этапов состоит жизненный цикл культуры клеток?

5  Чем отличается растущая однослойные культура клеток от пережива-

ющей?

   6  Какие культуры клеток называют диплоидными и перевиваемыми?

   7 Какие растворы и питательные среды используют в культивировании кле- ток?