Тема 6 Индикация вирусов в куриных эмбрионах

Цель занятия: овладеть методами вскрытия заражённых куриных эмбрионов и отбора вируссодержащего материала, ознакомиться с патологоанатомическими изменениями в курином эмбрионе; овладеть методикой капельной реакции гемагглютинации (РГА).

Заражённые эмбрионы ежедневно овоскопируют. Гибель эмбрионов в первые 24 часа после заражения чаще всего обусловлена размножением контаминантов (бактериальная микрофлора, грибы и др.), внесённых в эмбрион при заражении, а также травмированием. Эту гибель считают неспецифической и такие эмбрионы выбраковывают. В более поздние сроки гибель эмбриона, вероятно, вызвана репродукцией вируса.

В процессе инкубации в клетках структур куриного эмбриона вирус репродуцируется и накапливается в соответствующих полостях (аллантоисной, амниотической, желточном мешке). Эмбрионы инкубируют до максимального накопления вируса, что в среднем составляет от двух до восьми суток (зависит от вида/штамма вируса). Например, для вируса ньюкаслской болезни штамма Н, срок инкубации составляет два-три дня, для штамма В₁ – пять дней; для вируса инфекционного ларинготрахеита – пять дней; вируса оспы кур – шесть дней и т.д. 

Эмбрионы, погибшие до истечения полного срока инкубации, и выжившие, но срок их инкубации уже закончился, охлаждают при 0 - +4ºС (на два – три часа помещают в холодильник) для уплотнения тканей эмбриона, что значительно облегчает их вскрытие. Кроме того, при охлаждении кровь в сосудах сворачивается, что предупреждает кровотечение и возможность спонтанной адсорбции вирусов на эритроцитах в процессе вскрытия эмбриона и отбора вируссодержащего материала.

Признаки репродукции вируса в куриных эмбрионах. 1 Гибель эмбриона в период инкубации. 2 Патологоанатомические изменения в структурах куриного эмбриона (табл. 4).Таблица 4Патологоанатомические изменения в структурах заражённого куриного эмбриона

Структура куриного эмбриона	Вид при физиологической норме	Вид при репродукции вируса
1 ХАО	Тонкая, прозрачная, бесцветная, кровеносные сосуды хорошо выражены	Утолщённая (отёчная), мутная, бело - серого цвета, кровеносные сосуды не просматриваются; могут образовываться фокусы (оспины, очаги некроза, очаги пролиферации и др.)
2 Аллантоисная жидкость в аллантоисной полости	Прозрачная слегка опалесцирующая, соломенно-жёлтого цвета	Мутная, приобретает розово-красноватый оттенок (в результате гемолиза эритроцитов)
3 Желточный мешок	Оболочка прозрачная, бесцветная; содержимое – ярко жёлтого цвета	Оболочка мутная; изменение цвета содержимого
4 Тело зародыша	Соответствует сроку инкубации	Зародыш отстаёт в росте и развитии - феномен карликовости; обезвоживание или мумификация зародыша; деформация шеи (перекручивание) зародыша; на коже – гиперемия, кровоизлияния, отёки, оспины; внутренние органы изменены

Указанные в таблице 4 изменения на ХАО могут наблюдаться при заражении куриных эмбрионов вирусами оспы кур, инфекционного ларинготрахеита, болезни Марека, болезни Ауэски и др. При этом размеры и морфология фокусов заметно отличаются при репродукции вирусов разных видов (рис. 8). Рис. 8 Оспины на ХАО при заражении вирусом оспы курВирус инфекционного бронхита кур вызывает у куриных эмбрионов феномен карликовости, обезвоживание вплоть до мумификации. Тело зародыша может приобретать форму «таблетки», когда конечности плотно прижаты к голове. На рис. 9 представлены зародыши одного возраста инкубации, один из которых – не заражён, другие – заражены вирусом инфекционного бронхита кур.

1 – не заражённый куриный эмбрион 2 – куриный эмбрион в форме «таблетки 3 – мумификация и карликовость куриного эмбриона

Рис. 9 Не заражённый куриный эмбрион и заражённые вирусов инфекционного бронхита кур (по Майру и др.) Вирус гепатита утят, например, может вызывать гипертрофию печени куриного эмбриона, и изменение её цвета до жёлто-зелёного или тёмно-зелёного. Некоторые вирусы (в том числе вакцинные штаммы) при репродукции в куриных эмбрионах не вызывают гибели или каких-либо патологоанатомических изменений. Обнаружить такие вирусы можно лишь в том случае, если они обладают способностью агглютинировать эритроциты (т.н. гемагглютинирующие вирусы). Явление (феномен) гемагглютинации представляет собой склеивание эритроцитов в присутствии гемагглютинирующего вируса. Результатом этого является образование агглютинатов – агрегатов из склеенных эритроцитов. Гемагглютинирующими свойствами обладают вирусы, вирионы которых имеют структурный белок гемагглютин (HA), который чаще всего расположен в наружной оболочке вириона, и комплементарно взаимодействует с рецепторами на поверхности эритроцитов. Это приводит к адсорбции вирионов на эритроцитах. А если один вирион адсорбируется одновременно на нескольких эритроцитах, то это способствует их соединению между собой. При этом сам вирион «играет роль мостика» между эритроцитами – теория «мостиков» (рис.10). Образованием таких «мостиков» между многими эритроцитами и объясняется их склеивание в виде агглютинатов.При этом следует учитывать, что определённый  вид гемагглютинирующего вирусов взаимодействует с эритроцитами только определённого (определённых) вида «хозяина». Например, вирус ньюкаслской болезни агглютинирует только эритроциты кур, морских свинок, мышей, человека; вирус гриппа птиц – эритроциты кур, морских свинок, лошадей, овец и др.; вирус бешенства – эритроциты гуся, кур, морских свинок, овец, человека (I группа); вирус парагриппа-3 КРС – эритроциты морских свинок, с меньшей активностью – кроликов, свиней, КРС, мышей, обезьян, МРС.Для индикации гемагглютинирующих вирусов используют капельную реакцию гемагглютинации (РГА).

Рис. 10 Схема реакции гемагглютинации

Методика вскрытия куриных эмбрионов зависит от того, каким вирусом был заражён эмбрион, т.е. в какой структуре вирус репродуцировался и накапливался.

Вскрытие проводят в боксе с соблюдением правил работы с вируссодержащим материалом.

Вскрытие куриного эмбриона, заражённого в аллантоисную полость

Рис. 11 Отбор аллантоисной жидкости

1 Эмбрион помещают в штатив тупым концом вверх, скорлупу эмбриона обрабатывают 70° спиртом и фламбируют. 2 Срезают скорлупу над границей воздушной камеры. 3 Пинцетом надрывают подскорлупную оболочку и ХАО под ней со стороны зародыша (чтобы предотвратить случайный разрыв стенки желточного мешка и предотвратить смешивание его содержимого с аллантоисной жидкостью).

4 Отводят тело зародыша к центральной оси, из образовавшейся полости отбирают аллантоисную жидкость и ставят капельную РГА. Объём жидкости может достигать 10-15,0 мл (рис. 11).

Вскрытие куриного эмбриона, заражённого на ХАО

1 В зависимости от способа заражения эмбрион помещают в штатив вертикально тупым концом вверх (заражение через естественную воздушную камеру), или горизонтально (заражение через искусственную воздушную камеру). Скорлупу над воздушной камерой обрабатывают 70° спиртом и фламбируют.

2 Срезают скорлупу над той воздушной камерой, через которую заражали. При этом ножницы не должны повреждать подскорлупную оболочку под воздушной камерой.

3 ХАО осматривают, приподнимая её пинцетом, и выявляют в ней патологоанатомические изменения. Та часть ХАО, на которую был инокулирован вируссодержащий материал, обычно имеет наиболее выраженные изменения.

4 ХАО фиксируют пинцетом и вырезают по всей площади эмбриона, отслаивая её от скорлупы.

5 Переносят извлечённую ХАО в чашку Петри и тщательно промывают физиологическим раствором.

6 Расправив ХАО в один слой, просматривают её на тёмном фоне.

   Вскрытие куриного эмбриона, заражённого в амниотическую полость и в тело зародыша

Рис. 12 Отбор амниотической жидкости	1 Эмбрион помещают в штатив тупым концом вверх, скорлупу эмбриона обрабатывают 70° спиртом и фламбируют. 2 Срезают скорлупу над границей воздушной камеры. 3 Удаляют аллантоисную жидкость. Пинцетом, удерживая оболочку амниона над головой зародыша, отбирают амниотическую жидкость между головой и телом зародыша (в области шеи). Объём жидкости может достигать 1,0 мл (рис. 12).
Рис. 13 Извлечение тела зародыша	4 Извлекают тело зародыша, удерживая его пинцетом за шею (рис. 13). 5 Переносят зародыш в чашку Петри. 6 Проводят патологоанатомический осмотр тела зародыша и внутренних органов.

Вскрытие куриного эмбриона, заражённого в желточный мешок

1 Эмбрион помещают в штатив тупым концом вверх, скорлупу эмбриона обрабатывают 70° спиртом и фламбируют.

2 Делают насечки на скорлупе по всему периметру. Аккуратно раздвигают две половинки скорлупы над чашкой Петри.

3 Извлекают зародыш со всеми оболочками (рис. XVI).

4 Выделяют желточный мешок с содержимым, стенку разрезают ножницами и отполаскивают от содержимого физиологическим раствором.

Отобранный вируссодержащий материал можно подвергнуть бактериологическому контролю.

Методика постановки капельной реакции гемагглютинации

1 На керамическую пластину наносят каплю аллантоисной жидкости и добавляют к ней каплю 5,0 % суспензии эритроцитов определённого вида животного и перемешивают.

2 Реакцию учитывают визуально через 1 – 3 мин. по наличию хлопьев агглютинированных эритроцитов (рис. XVII).

Материальное обеспечение: заражённыекуриные эмбрионы, 5 % суспензия эритроцитов, овоскоп, штативы для куриных эмбрионов, лоток эмалированный, стерилизатор со стерильным инструментарием (ножницы глазные, пинцет анатомический), механический дозатор с наконечниками, чашка Петри, керамическая пластина, газовая горелка, 70° этиловый спирт, ватные тампоны, термостат.

Примерный план занятия (2 часа)

1 Проведение тестирования студентов 

2 Объяснение преподавателя по теме занятия.

3 Демонстрация: а) методов вскрытия куриных эмбрионов и отбора вируссодержащего материала; б) методики постановки капельной РГА.

4 Самостоятельная работа студентов: а) вскрытие куриных эмбрионов и отбор вируссодержащего материала; б) постановка капельной РГА.

4 Подведение итогов занятия

5 Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1 Какие признаки репродукции вирусов обнаруживают в курином эмбрионе?

2 Какие патологоанатомические изменения могут быть в структурах эмбриона?

3 В чём состоит методика вскрытия куриного эмбриона, заражённого в аллантоисную полость?

4 В чём состоит методика вскрытия куриного эмбриона, заражённого на ХАО?

5 Что такое гемагглютинирующая активность вируса?

6 В какой реакции проводят индикацию гемагглютинирующих вирусов?