Методы индикации вируса в культуре клеток

Для индикации вирусов в культуре клеток используют разные методы. К ним относят световую микроскопию цитопатического действия вируса, световую микроскопию внутриклеточных телец-включений, реакцию гемадсорбции, реакцию иммунной флуоресценции, метод бляшкообразования, иммуноферментный анализ и т.д.

Индикацию вируса по ЦПД (ЦПЭ) проводят методом световой микроскопии. Для этого микроскопируют заражённую и контрольную культуру клеток. Выявляют морфологические изменения клеток в заражённой культуре по сравниваю с контрольной. Любые отличия в морфологии заражённых клеток от контрольных следует считать проявлениями ЦПД (рис. 18, 19, 20). Одни вирусы вызывают ЦПД в клетках уже через 24-48 часов, другие – через 5-7 суток.

Интенсивность ЦПД выражают в процентах («крестах») от площади изменённого монослоя. Например, если изменён весь монослой клеток – 100 %, то это оценивают на  ++++; если 75 %  –  +++; 50 %  –  ++; 25 %  – +.

Рис. 15 Перевиваемая культура клеток почки телёнка (ПТ-80) - контроль	Рис. 18 Цитопатическое действие аденовируса КРС в культуре клеток ПТ-80
Рис. 16 Перевиваемая культура клеток коронарных сосудов телёнка (КСТ) - контроль	Рис. 19 Цитопатическое действие вируса вирусной диареи КРС в культуре клеток КСТ
Рис. 17 Перевиваемая культура клеток почки зелёной мартышки (VERO)	Рис. 20 Цитопатическое действие вируса парагриппа–3крс в культуре клеток VERO

 

ЦПД можно учитывать и по изменённой морфологии клеток, что зависит от биологических свойств самого вируса, морфологических особенностей самой клетки, дозы заражения и т.д. Различают три основных типа ЦПД: округление клеток, их фрагментация и слияние с образованием симпластов (симпластообразование).

Округление клеток – это потеря клетками способности адгезироваться на поверхности культурального флакона. Клетки приобретают округлую форму, десорбируются и переходят в свободно-взвешенное состоянии в питательной среде. Такой вид ЦПД чаще встречается при не литической форме вирусной инфекции (аденовирусы, вирус вирусной диареи и др.).

Фрагментация клеток – это разрушение клеток при репродукции вируса с образованием отдельных фрагментов (клеточный детрит), которые находятся в свободно-взвешенном состоянии в питательной среде. Такой вид ЦПД характерен для литической формы вирусной инфекции в клетке (вирус ящура, везикулярного стоматита и др.).

Симпластообразование (рис.21) – это слияние клеточных оболочек и объединение цитозолей клеток с образованием гигантских многоядерных структур неправильной формы (вирус болезни Ауэски, ринопневмонии лошадей и др.).

Рис. 21 Слияние клеток с образованием симпластов (ЦПД)

В том случае, если морфология заражённых клеток не отличается от морфологии клеток в контроле, то такой пассаж вируса следует называть «слепым», что ещё не даёт основания утверждать об отсутствии вируса.        Индикация гемадсорбирующих вирусов. Гемадсорбция – адсорбция эритроцитов на поверхности клеток, заражённых гемадсорбирующимвирусом. Такие вирусы имеют в своей наружной оболочке белок гемагглютинин, комплементарно взаимодействующий с рецептором эритроцита. Этот принцип лежит в основе реакции гемадсорбции (РГАд).

Для постановки РГАд культуру клеток заражают вирусом. Через 10-12 час после инкубации удаляют питательную среду из заражённой и контрольной культуры клеток и вносят 0,5 %–ую суспензию эритроцитов определённого вида животного. Через 5-10 мин культуру клеток отмывают физиологическим раствором и просматривают под световым микроскопом. В контрольной культуре клеток не обнаруживают эритроциты на клетках, тогда как в культуре клеток заражённой гемадсорбирующим вирусом– эритроциты адсорбированы на поверхности клеток.

Эритроциты на заражённых клетках могут адсорбироваться или по периферии клеточного монослоя в виде «ожерелья», или очагами в виде «ягоды малины», или диффузно по всему монослою клеток.

Индикация вирусов в культуре клеток по образованию бляшек. Метод основан на образовании бляшек в однослойных культурах клеток под агаровым покрытием с индикатором. Бляшки представляют собой участки лизированных клеток в монослое в результате репродукции вируса.

Материальное обеспечение: световой микроскоп; матрасы с перевиваемыми культурами клеток, демонстрационные препараты для световой микроскопии.

Примерный план занятия (2 часа)

1 Проведение тестирования студентов 

2 Объяснение преподавателя по теме занятия.

3 Демонстрация метода световой микроскопии ЦПД вируса в культуре клеток и РГАд.

4 Самостоятельная работа студентов: а) световая микроскопия заражённой вирусом культуры клеток; б) выполнение рисунков различных видов ЦПД вируса в перевиваемых культурах клеток и результа РГАд.

4 Подведение итогов занятия

5 Задание к следующему занятию

Контрольные вопросы

1 В чём состоит методика заражения вирусом культуры клеток?

2 Что такое цитопатическое действие (ЦПД) вируса в культуре клеток? Типы ЦПД?

3 Что такое гемадсорбция? В чём состоит принцип индикации гемадсорбирующих вирусов?

4 Какие методы используют для индикации вирусов в культуре клеток?